药品无菌检查

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,药品无菌检查,主要内容,1,、,药品无菌检查法基础,2,、,2015,年版药典无菌检查法的变动,3,、洁净实验室微生物的监测和控制,4,、菌种的管理,5,、二级生物安全实验室,药品无菌检查法,定义及特点,培养基、冲洗液,方法学验证,供试品的无菌检查,无菌检查的要点,药品无菌检查法,无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。,若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在,该检验条件下,未发现微生物污染。也并不表示所有的产品都是无菌的。,反之，当供试品中检出微生物污染，则可以认为批产品的微生物污染风险相当高。,药品无菌检查法,无菌制剂比非无菌制剂存在更高的风险,一系列的药品不良事件,2006,年的“欣弗事件”,-,安徽华源生产的“克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液”引起了,11,人死亡，,93,人感染，企业倒闭，总经理自杀。未按批准的工艺参数灭菌，降低灭菌温度、缩短灭菌时间，增加灭菌柜装载量，影响了灭菌效果，经中检所检验，发现无菌不合格。,2012,年,10,月，美国新英格兰合成制药中心生产的注射用类固醇霉菌污染，造成数百人感染真菌脑炎，至年底统计死亡,39,人。,这些事故促使无菌制剂,GMP,监管的进步，同时也对无菌检验提出更高更严的要求。,药品无菌检查法,特点,无菌检验结论为,一次性,，药典规定为不得复试，为什么不得复试，菌落的分布具有不均匀性，检验过程是破坏性的，不具有重复性。,-,对操作过程的要求非常高。,过程的控制,-1,、环境控制；,2,、操作影响，人员、物流是否引入外源性污染？,无菌性检查,灵敏度检查,SOP,操作,有效的结果,有效的方法,环境保证,培养基保证,方法学验证,过程控制,结果判断,可靠的结论,药品无菌检查法,培养基,配制后采用,验证合格,的灭菌程序灭菌。,什么是验证合格的？,保存条件：,2-25,、避光，非密闭容器在,3,周内使用，密闭容器一般在,1,年内使用。,流乙醇酸盐流体：供试品接种前，培养基氧化层不超过深度的,1/5,，否则,100,水浴加热至粉红色消失（不超过,20,分钟），只能加热一次，培养结束后氧化层不超过,1/2,药品无菌检查法,药品无菌检查法,培养基适用性检查,无菌性,每批次培养基取不少于,5,瓶（支），培养,14,天，应无菌生长。,灵敏度,6,种菌（,100cfu,）,金、铜绿、生孢,-,流乙醇酸盐流体,7,支，,12ml/,支，每种菌接种,2,支，阴性一支，,枯草、白念、黑曲,-,胰酪大豆胨液体,7,支，每种菌接种,2,支，,9ml/,支，一支阴性,流乙醇酸盐流体培养,3,天，胰酪大豆胨液体,5,天， 空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判断该培养基的灵敏度符合规定,药品无菌检查法,冲洗液,0.1%,蛋白胨水溶液,氯化钠,-,蛋白胨缓冲液,可选用其他经验证过的适宜的溶液,药品无菌检查法,方法适用性试验,证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进行方法适用性试验。,菌种：,金葡、大肠、枯草、生孢、白念、黑曲,方法：,1,、薄膜过滤,2,、直接接种,药品无菌检查法,薄膜过滤法,试验组：,取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次冲洗液中加入小于,100cfu,的试验菌，过滤。将培养基加至滤筒内。,对照组：,另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，培养时间不得超过,5,天。,药品无菌检查法,直接接种法,取流乙醇酸盐流体培养基（不少于,15ml,）,6,管，分别加入金葡、大肠、生孢各,2,管，其中一管接入供试品，另一管作为对照，,TSB,（不少于,10ml,）,6,管，分别加入枯草、白念、黑曲各,2,管，其中一管加入供试品，另一管作为对照，培养时间不得超过,5,天。,结果判断：,与对照管比较，试验组的试验菌生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或抑菌作用可以忽略不计；,如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长,-,供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用,-,增加冲洗量、培养基用量、中和剂或灭活剂、更换滤膜品种，重新进行方法适用性试验。,药品无菌检查法,供试品的无菌检查,检验数量：一次试验所用供试品最小包装容器的数量,出厂产品按表,1,，上市产品监督检验按表,2,最少检验数量不包括阳性对照用的。,检验量：按表,3,，采用薄膜过滤法时，只要供试品特性允 许，应将所有容器内的全部内容物过滤。,药品无菌检查法,1,、薄膜过滤法,封闭式薄膜过滤器,只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤,抗生素样品选用低吸附的滤膜,水溶性供试品过滤前先将少量冲洗液过滤以润湿滤膜,油类供试品的滤膜和滤器在使用前应充分干燥,冲洗量一次一般为,100ml,，总冲洗量不得超过,1000ml,，以免膜上的微生物受损。总冲洗量特别大时应尽量减小流速。,药品无菌检查法,水溶性的液体,-,直接过滤或混合至含不少于,100ml,适宜稀释液的无菌容器中，混匀，立即过滤，如供试品有抑菌作用，须冲洗一般不少于三次。,水溶性的固体,-,溶取规定量，加适宜的稀释液溶解或按标签复溶。,非水溶性供试品,-,直接过滤，或乳化后（加吐温,80,等）立即过滤，用含,0.1-1%,吐温,80,的冲洗液冲洗，培养基中可加入吐温,80,可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油性供试品,-,溶解于适量无菌十四烷酸异丙酯中，过滤，加热仍然没法过滤的，萃取，静置，取水层过滤,无菌气雾剂,-,在,-20,冷冻,1,小时，取出在容器上钻一小孔释放抛射剂后再无菌开启容器，转移至无菌容器中。,装有药物的注射器供试品,注意应采用适宜的方法进行包装中所配带的无菌针头的无菌检查,带有导管的医疗器具（输血、输液袋等）,-,每个最小包装用,50-100ml,冲洗液分别冲洗内壁，过滤冲洗液。同时注意应采用直接接种法对配带的无菌针头做无菌检查,药品无菌检查法,2,、直接接种法,培养基的用量符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的,10%,，同时，流乙醇酸盐每管装量不少于,15ml,，,TSB,不少于,10ml,适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的。,药品无菌检查法,混悬液等非澄清水溶液供试品,取规定量，等量接种至各管培养基中,固体供试品,取规定量，直接等量接种至各管培养基中，或加入适宜的溶剂溶解，或按标签说明复溶后，取规定量等量接种至各管培养基中。,非水溶性供试品,加入适量的乳化剂及稀释剂使其乳化再接种，或直接接种至含乳化剂的培养基中,敷料供试品,以无菌操作拆开每个包装，于不同部位剪取约,100mg,或,1cm*3cm,的供试品，等量接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。,肠线、缝合线等供试品,取最小包装，无菌拆开包装，等量接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。,灭菌医用器具供试品,必要时将其拆散或切成小碎段，等量接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。,放射性药品,取供试品,1,支，等量接种于装量为的流乙醇酸盐流体培养基和,TSB,中。每管接种量为。,药品无菌检查法,阳性对照,无抑菌作用及抗革兰氏阳性菌为主的,-,金葡,抗革兰氏阴性菌为主的,-,大肠,抗厌氧菌的,-,生孢梭,抗真菌的,-,白念,阳性对照,72,小时内,生长良好,阴性对照,相应的溶剂、稀释液、冲洗液同法操作， 不得有菌生长,药品无菌检查法,培养及观察,液体培养基浑浊,物理变化？化学变化？生物学变化？,培养,14,天，,逐日观察并记录，,注意和阳性、阴性对比，培养,14,天后依然无法从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液,转种,至同种新鲜培养基，培养,3,天，观察是否再次出现浑浊。,药品无菌检查法,若明显浑浊,-,怎么办？,1,）立即转接,2ml,该培养物至相同的培养基中继续培养；,2,）取,5,支冻存管，每管分装,1ml,浑浊培养物，,-80,保存；,3,）取浑浊培养物在,TSA,平板,/,血琼脂上划线，分离污染微生物；,4,）如果发现硫乙醇酸盐流体培养管变浑浊，还应增加血平板划线，并在厌氧条件下培养分离厌氧菌。由平板分离到的菌落应进一步鉴定，并逐一保藏。,药品无菌检查法,结果判断,阳性对照生长良好，阴性不得有菌，否则试验无效,若供试品澄清，或虽然浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定,若任何一管浑浊并确证有菌生长，判不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，符合下面至少一个条件：,1,、无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求,2,、回顾试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素,3,、供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。,若确认无效，应重试。,药品无菌检查法,要点,一个标准的,SOP,，物料进场，外围消毒剂消毒表面，拆除外包装，洁净传递，风淋、紫外照射，过氧化氢灭菌等，由低级别向高级别递进，最后到达,A,级核心区,人员进场，合理的更衣程序，,A/B,级：应用头罩将所有头发以及胡须等相关部位全部遮盖，必要时戴防护目镜。应戴经灭菌且无颗粒物（如滑石粉）散发的橡胶或塑料手套，穿经灭菌或消毒的脚套，裤腿应塞进脚套内，袖口应塞进手套内。工作服应为灭菌的连体工作服，不脱落纤维或微粒，并能滞留身体散发的微粒。,无菌操作技术，动作熟练，关键点的控制,实验过程的监控：环境菌，表面微生物，手部微生物，对环境菌进行鉴定，建立档案，以便,OOS,调查，进行溯源。,2015,年版药典的变化,主要修订点,改良马丁培养基修订为胰酪大豆胨肉汤培养基（,TSB,）,无菌检查实验条件由“万级下的局部百级”修订为“,B+A,”,三部药典的统一,2015,年版药典的变化,药典,2010,年版,2015,年版,名称,改良马丁培养基,胰酪大豆胨液体培养基,配方,蛋白胨,-5.0g,胰酪胨,-17.0g,酵母浸出液,-2.0g,大豆木瓜蛋白酶水解物,-3.0g,葡萄糖,-20.0g,氯化钠,-5.0g,磷酸氢二钾,-1.0g,磷酸氢二钾,-2.5g,硫酸镁,-0.5g,葡萄糖,-2.5g,目的,培养真菌,需氧菌、真菌、专性和兼性厌氧菌,培养条件,23-28,20-25,培养基的变化,2015,年版药典的变化,意义,1,、与国际接轨,USPBP,2,、培养,-,观察的体系改变，取消严格意义上的以真菌、细菌划分的培养，而以需氧、厌氧的培养体系来划分，是一个更加广泛，更加互补的体系。,2015,年版药典的变化,培养基的改变导致阳性菌的培养条件改变,培养基灵敏度实验：,2015,年版药典的变化,方法适用性实验：,2015,年版药典的变化,菌种的培养条件改变,2015,年版药典的变化,无菌检查实验条件,由“万级下的局部百级”修订为“,B+A,”,和以前的,100,级、,10000,级的区别？需要怎么控制环境？,洁净实验室,洁净室的定义及分级,两版药典对洁净室的要求对比,洁净室微生物的监测与控制,微生物鉴定,隔离器简介,消毒剂的选择与使用,几种空间灭菌方法,洁净实验室,洁净室的定义与分级,药品洁净实验室是指用于药品无菌或微生物检验用的洁净实验室、隔离系统及其它受控环境。,洁净室不是绝对无菌的。,概念不等于无菌室（命名需准确）,洁净实验室,洁净室的分级,ISO14644-,按悬浮粒子大小划分了洁净室的级别（等级,1-9,级）,ISO14698-,洁净室及其相关控制环境,洁净实验室,各国不同法规对于洁净室污染控制的要求对比,美国联邦标准,FED-STD-209E,：,率先建立了由悬浮粒子含量规定空气洁净度的分级标准，以每立方英尺空气所含最大允许微粒的数量确定，分为,1,、,10,、,100,、,1000,、,10000,、,100000,六个级别。,国际标准,ISO14644-1,：,空气洁净度分为,9,个级别，比美国联邦标准多出,3,个。,美国,FDA,无菌工艺药品,CGMP,工业指南,：,以动态期间在物料漏置临近处所测数据为依据，强调了动态概念，对微生物进行了控制，,100,、,1000,、,10000,、,100000,对应,ISO5,、,6,、,7,、,8,美国药典,1116,：,根据美国联邦标准改编，M1-M7,欧盟GMP：A、B、C、D，静态、动态监测、强调了粒子的在线监测,2010年版GMP:等同于欧盟,洁净实验室,按空气悬浮粒子大小和数量的不同参考现行“药品生产质量管理规范”分为,A,、,B,、,C,、,D 4,个级别。,洁净实验室,初次使用的洁净实验室应进行参数确认，确认参数包括物理参数、空气悬浮粒子和微生物。,物理参数,空气悬浮粒子,微生物,浮游菌,沉降菌,表面微生物,空气过滤器完整性，气流组织、空气流,速，换气次数、压差、温度和相对湿度,参数确认,执行标准,洁净室施工及验收规范,附录,D3,高效空气过滤器现场扫描检漏方法粒子计数器法、,附录,E12,气流的检测、,附录,E1,风量和风速的检测、,附录,E2,静压差的检测、附录,E5,温湿度的检测,洁净实验室,2015,年版与,2010,年版的物理指标相比,100,级与,A,级比较，单向流断面风速相差较大，,100,级洁净区需要增加循环风量才能达到,A,级，,10000,级洁净区空调系统需要增加,1,倍的送风量，才能达到,B,级,洁净实验室,洁净室微生物监测和控制,定期清洁、消毒、消毒效果验证,包括：非生物活性的空气悬浮粒子数和有生物活性的微生物监测，其中微生物监测包括环境浮游菌和沉降菌监测，及关键的检测台面、人员操作服表面及,5,指手套等的微生物检测。,洁净实验室,悬浮粒子,用于空气洁净度分级的空气悬浮粒子尺寸范围在,m-1000,m,的固体和液体粒子。,洁净实验室,方法：,GB/T16292-2010,医药工业洁净室（区）悬浮粒子的测试方法,采样点数目：,最少采样数，两种方法，,一、,NL,最少采样点,A,洁净室或被控洁净区的面积，单位为平方米（单向流，垂直于气流方向上的横截面积）,洁净实验室,二,|,查表,洁净实验室,采样点位置与分布：,离地面高度的水平面上均匀分布,采样点多于,5,点时，也可在离地面高度的区域内分层布置，每层不少于,5,点,静态测试时，采样点布置力求均匀（附录,A,），动态测试，应根据关键操作区布置。,洁净实验室,采样次数：,对任何小洁净室（区）或局部空气净化区域，采样点数目不少于,2,个，总采样次数不少于,5,次，每个采样点的采样次数可以多于,1,次，不同采样点的采样次数可以不同,每次采样量：,洁净实验室,计算：,（计算详细见,GB,标准）,结果：,每个采样点的平均悬浮粒子浓度必须不大于规定的级别界限,全部采样点的悬浮粒子浓度平均值均值的,95%,置信上限必须不大于规定的级别界限，,UCL,级别界限,洁净实验室,浮游菌、沉降菌,：,洁净度级别,2010,年版,浮游菌,/m,3,沉降菌,/,皿，,0.5h,100,5,1,1000,10000,100,3,100000,500,10,洁净实验室,方法：,GB/T16293-2010,医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法,GB/T16293-2010,医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法,浮游菌,最少采样点,参照悬浮粒子,GB/T16292-2010,采样点的位置,参照悬浮粒子,GB/T16292-2010,工作区测点位置离地左右（略高于工作面）,送风口测点位置离开送风面,30cm,左右。,可在关键设备或关键工作活动范围处增加测点。,采样次数,每个采样点采样一次,洁净实验室,最小采样量：,洁净度级别,采样量,L/,次,100,1000,10000,500,100000,100,300000,100,注意事项,单向流区域，采样器采样口朝向应正对气流方向；非单向区域，采样口朝上。,采样点避开回风口。,测试人员站在采样口的下风侧，尽量少走动。,为避免培养皿运输或搬动过程的影响，应对培养皿做阴性对照（不暴露采样），应无菌生长。,记录,测试者名称，日期，测试依据，洁净室的平面位置，测试仪器，方法描述，包括测试环境条件，采样点位置，布置图，测试次数，采样量，测试仪器检定证书，动态测试应记录现场人员数量位置，设备的数量和位置，测试结果。,洁净实验室,结果,每点浮游菌平均浓度（个,/m,3,）,=,菌落数,/,采样量,结果评定,每个测点的浮游菌平均浓度必须低于标准的界限,静态测试，某点浮游菌平均浓度超过评定标准，则应重新采样两次，两次结果均合格才能判定为合格。,洁净实验室,沉降菌,最少采样点参照悬浮粒子,GB/T16292-2010,采样点的位置参照悬浮粒子,GB/T16292-2010,最少培养皿数,洁净度级别,最少培养皿数（,90mm,）,100,14,10000,2,100000,2,300000,2,洁净实验室,结果计算,平均菌落数,=(M,1,+M,2,+M,N,)/N,M,1,1,号培养皿菌落数,N,培养皿总数,结果评定,同浮游菌,洁净实验室,表面微生物,表面微生物测定是对环境、设备和人员的表面微生物进行监,测，方法包括接触碟法和擦拭法。,接触碟法,将充满规定的琼脂培养基的接触碟对规则表面或平面进行取样，然后置合适的温度下培养一定时间并计数，每碟取样面积约为,25 cm2,，微生物计数结果以,cfu/,碟报告；,擦拭法,接触碟法的补充，用于不规则表面的微生物监测，特别是设备的不规则表面。擦拭法是采用合适尺寸的无菌模板确定擦拭的面积，取样后，将拭子置合适的缓冲液或培养基中，充分振荡，然后采用适宜的方法计数，每个拭子取样面积为约,25 cm2,，微生物计数结果以,cfu/,拭子报告。,接触碟法和擦拭法采用的培养基、培养温度和时间同浮游菌或沉降菌（一般采用,TSA,，当监测结果有疑似真菌或考虑季节因素影响时，可增加,SDA,）,表面菌测定应在实验结束后进行。,洁净实验室,推荐的药品洁净实验室的监测频次及监测项目,洁净度级别,悬浮粒子,浮游菌,沉降菌,表面微生物,A,级,每月,每月,每次,每次,B,级,每季度,每季度,每周,每周,C,级,每半年,每半年,每季度,每季度,D,级,每半年,每半年,每半年,每半年,洁净实验室,如果出现连续超过纠偏限和警戒限、关键区域内发现有污染微生物存在、空气净化系统进行任何重大的维修、消毒规程改变、设备有重大维修或增加、洁净室（区）结构或区域分布有重大变动、引起微生物污染的事故、日常操作记录反映出倾向性的数据时应考虑修改监测频次。,洁净实验室,洁净实验室,偏差处理,当微生物监测结果超出警戒限度和纠偏限度时，应当按照偏差处理规程进行报告、记录、调查、处理以及采取纠正措施，并对纠正措施的有效性进行评估。,微生物鉴定,建议对受控环境收集到的微生物进行适当水平的鉴定,1,、有助于预期常见菌群。,2,、有助于评估清洁,/,消毒方法、消毒剂的有效性。,3,、有助于污染源的调查，辅助,OOS,调查。,洁净实验室,微生物鉴定,通则,9205,“药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则”建议对洁净室和其他受控环境分离到的微生物进行鉴定，以掌握环境微生物污染情况，有助于污染调查。,无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺（如培养基灌装）失败时，对检出的微生物鉴定至少达到种属水平，必要时达到菌株水平。,洁净实验室,微生物鉴定,借助现有的分类系统，通过对未知微生物的特征测定，对其进行细菌、酵母菌和霉菌大类的区分，或属、种及菌株水平确定的过程。,洁净实验室,鉴定程序,分离纯化,初筛试验,表型微生物鉴定,基因型微生物鉴定,（,16SrDNA,、,18SrDNA,、聚合酶链式反应、,DNA-DNA,杂交、焦磷酸测序、多位点序列分型等 ）,洁净实验室,分离纯化,纯培养物是指来源于同一单细胞的细胞群体,平板划线法是最常用的技术,洁净实验室,初筛试验,（革兰氏染色、芽孢染色、镜检观察细胞形态、重要的生化反应）,重要的生化筛选试验,氧化酶试验：,氧化酶阳性：不发酵的革兰氏阴性杆菌、,氧化酶阴性：肠道菌,过氧化氢酶试验,阳 性：葡萄球菌,阴性：链球菌,凝固酶试验,阳 性：致病性,阴性：非致病性,洁净实验室,表型微生物鉴定,培养物,（菌落形态、菌落颜色、形状、大小和产色素）,形态学,（细胞形态、大小、形状、鞭毛、内容物、革兰氏染色、芽孢 和抗酸染色、孢子形成模式）,生理学,（氧气耐受性、,pH,值范围、最适温度和范围、耐盐性）,生化反应（,碳源利用、碳水化合物的氧化或发酵、酶的模式）,抑制性,（胆盐耐受性、抗生素敏感性、染料耐受性）,血清学,（凝集反应、荧光抗体）,化学分类,（脂肪酸构成、微生物霉素、全细胞组分）,生态学,（微生物来源）,洁净实验室,基因型微生物鉴定,微生物由于特殊环境的影响，表型特征常发生变异，传统形态学鉴定手段难以得到种水平结果，以其核酸序列为鉴定基础，从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系,（,16SrDNA,、,18SrDNA,、聚合酶链式反应、,DNA-DNA,杂交、焦磷酸测序、多位点序列分型等 ）,洁净实验室,洁净实验室,洁净实验室,伯杰氏系统细菌学手册,对细菌的分类是通过遗传物质的分析比较来实现。,基因鉴定法不但技术需要保证，还需要昂贵的分析设备和材料，通常在关键微生物调查中使用，如产品不合格调查，若使用，方法必须经过,确认,鉴定方法的确认包括：准确度、专属性、重现性、灵敏度、阳性预测值、阴性预测值,洁净实验室,隔离器,分类：硬仓、软仓,结构：,1,、空气处理系统（高效空气过滤器）,2,、传递接口及传递门,3,、灭菌设备（一般为过氧化氢、过氧乙酸等灭菌）,4,、配套设备与辅助设备,洁净实验室,洁净实验室,洁净实验室,隔离系统的验证,1,、操作验证,2,、隔离器完整性验证,3,、灭菌验证,4,、灭菌循环验证,5,、隔离器内部洁净度验证,6,、仪器仪表验证,洁净实验室,药品洁净实验室怎样实现微生物的良好控制？处于受控状态？,1,、硬件设施的满足,洁净室的验收应符合规范，换气次数，送风量、环境温湿度等等,2,、良好的环境管理， 清洁、消毒程序，并严格执行，选择适当的消毒方式，合理的消毒剂，清洁消毒频率。监测到位。,3,、减少人员干预，人是最大的污染源，规范人员进出洁净区的程序，严格按照,A/B,洁净区的要求做好人员防护。做好人员培训。,4,、控制物流的干扰，做好物流的消毒、外表面灭菌工作，减少物流的污染,5,、应当对监测数据进行分析、回顾，通过收集的数据和趋势分析，总结和评估洁净实验室是否受控。,洁净实验室,消毒剂的选择与使用,微生物的抗力,从小到大排列一般为：,细菌繁殖体,真菌繁殖体,真菌孢子,病毒,分枝杆菌,细菌芽孢,洁净实验室,消毒剂选择、使用,将消毒剂种类分为四个作用水平,（,1,）灭菌：可杀灭一切微生物（包括芽孢）达到灭菌保证水平的方法。甲醛、戊二醛、环氧乙烷、过氧乙酸、过氧化氢等。,（,2,）高水平消毒法：可以杀灭各种微生物，对芽孢杀灭达到消毒效果的方法。这类消毒方法应能杀灭一切细菌繁殖体（包括结核分枝杆菌）、病毒、真菌及其孢子和绝大多数细菌芽孢。用含氯、二氧化氯、过氧乙酸、过氧化氢、含溴消毒剂、臭氧、二溴海因等甲基乙内酰脲类化合物和一些复配的消毒剂等消毒因子进行消毒的方法。,（,3,）中水平消毒法：杀灭和去除细菌芽孢以外的各种病原微生物的消毒方法，碘类消毒剂,(,碘伏、碘酊等,),、醇类、醇类和氯已定的复方，醇类和季铵盐类化合物的复方、酚类等消毒剂进行消毒的方法。,（,4,）低水平消毒法：只能杀灭细菌繁殖体（分枝杆菌除外）和亲脂病毒的化学消毒剂。如单链季铵盐类消毒剂,(,苯扎溴铵等,),、双胍类消毒剂如氯己定、植物类消毒剂和汞、银、铜等金属离子消毒剂。,消毒剂种类,推荐使用浓度,用途,注意事项,苯酚（石炭酸）,3,%,5%,工作台面、器皿消毒,中等毒,来苏儿,1,%,3%,（皮肤、器械）；,3,%,5%,（器皿、污染物、工作台面）,皮肤、器械、器皿、污染物、工作台面,中等毒,新洁而灭,0.25%,皮肤、小型器皿,对病毒、芽孢无效,乙醇,70,%,75%,皮肤、金属器具、生物安全柜内表面,易挥发自燃,碘伏,0.3,%,0.5%,皮肤,低温不发挥效能,氯消毒剂（二氧化氯、次氯酸钠、次氯酸钙等）,0.1,%,0.5%,工作台面、环境、器皿、污染物等广泛使用,腐蚀金属、高浓度对人有刺激性，污染环境,漂白粉,0.5,%,1%,（,5min,杀菌）；,5%,（,1h,杀芽孢）,空气、表面、地面消毒、污染物处理,腐蚀金属、高浓度对人有刺激性，污染环境,过氧化氢,3%,细菌污染器皿，口腔黏膜,不稳定、易氧化金属，现用现配，刺激性大，需戴手套、防护镜,过氧乙酸,0.2,%,0.4%,（,3min,）；,0.50%,皮肤；一般物品,不稳定、严禁与金属接触，现用现配，刺激性大，需戴手套、防护镜,过氧乙酸,2%,（,8ml/m3,）,1h,空气,空气湿度越大越好，灭菌后通风,甲醛,加热熏蒸至少,8,小时,空气,空气相对湿度,70%,以上,臭氧,2.5mg/,L,5mg/L(2h),空气,空气湿度越大越好，灭菌后通风,戊二醇,0.2mg/,L,1mg/L(10-15min),怕高温、怕腐蚀的医疗器械,盛装容器必须加盖,洁净实验室,消毒剂的配制：,1,、按供应商的使用说明配制和储存。,2,、,A/B,级区域应使用经除菌过滤的消毒剂。,3,、尽量高级别的水配制，纯化水、灭菌水、注射用水,配好后放置一会。,影响消毒剂效力的因素：,浓度、接触时间、,pH,值、温度、微生物的数量和种类,洁净实验室,消毒剂的选择原理,1,、根据市售消毒剂的抗菌谱、根据区域等级，,A/B,级选用杀孢子剂，其他区域可配合使用其他水平的消毒剂，定期使用杀孢子剂。,2,、根据使用说明，规范使用浓度和作用时间,3,、根据待消毒表面的材质。如对设备表面的腐蚀程度对操作者的安全性。（残留、腐蚀、粘膜刺激）,4,、和清洁剂，其他消毒剂的相容性,5,、选用多种类的消毒剂，交替使用，避免微生物对其产生耐受性。,洁净实验室,几种空间灭菌方法：,熏蒸灭菌概念,1980,年收录于,USP,，在一定温度和压力的密闭条件下，化学消毒剂转为气态渗透到生物体内，使生物致死。有助于降低洁净区死角的微生物污染。,甲醛：,对所有微生物都有杀灭作用。杀孢子剂,通常推荐,12,小时灭菌时间，排气、通风至少,24,小时，过程漫长，有致癌作用，现在已很少使用,臭氧：,对,所有微生物都有杀灭作用。杀孢子剂,无残留，无污染，臭氧对人体有害，为强氧化剂，对多种物品有损坏，橡胶老化、铜片生锈，织物褪色等,。,过氧化氢：,对所有微生物都有杀灭作用。杀孢子剂,2H,2,O,2,2 H,2,O+O,2,过氧化氢灭菌安全，环境友好，不产生有毒有害残留物最终分解产物为,H,2,O,和,O,2,，无毒无残留。,洁净实验室,紫外消毒的应用,紫外线：空气消毒、物体表面消毒,用,UV,进行表面消毒时，要求灯管距离污染表面不超过,1m,，,30WUV,灯照射时，照射时间不应短于,30,分钟，灯管周围为消毒有效区。,应对灯的紫外线照射强度进行监测，当强度低于规定值时，及时更换。,方法：,生物指示剂,/,物理学检测,生物指示：,大肠杆菌，照射剂量应达到,20000ws/cm,2,枯草杆菌黑色变种芽孢应达到,100000ws/cm,2,。,物理学检测方法：,灯管的紫外线强度（,w/cm,2,）用中心波长为,253.7nm,的紫外线强度测定仪（标定有效期内），在灯管垂直位置,1m,处测定。,洁净实验室,判定指标,（,1,）电压,220V,，室温,20,25,，紫外线辐射强度（垂直,1m,处）,普通,30W,直管型紫外线灯,70w/cm,2,；,高强度紫外线灯 ,200w /cm,2,。,（,2,）表面消毒接受的照射剂量，应达杀灭目标微生物所需。应达到,100000w.s /cm,2,。,剂量（,w.s /cm,2,）,=,辐射强度（,w/cm,2,）,时间（,s,）。,菌种的管理,9203,药品微生物实验室质量管理指导原则,药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的可以溯源的商业派生菌株。,CMCC-,中国医学菌种保藏中心,CMCC,（,F,）,CMCC,（,B,）,F-,真菌；,B-,细菌,ATCC-,美国标准菌种收藏中心,菌种的管理,定义,标准菌株,至少定义到属或种水平的菌株。按其特征进行分类和描述，有明确的来源。,标准储备菌株,从国内或国外菌种保藏机构获得的标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。应进行纯度和特性确认。可用于制备每月或每周,1,次转种的工作菌株。,工作菌株,由标准菌株、标准储备菌株转接后获得的同种菌株。工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过,5,代。,菌种的管理,菌种的管理,申购：,菌种管理人员提出购买申请,验收：,接受菌种时应检查菌种的名称，代号，数量，完整性，记录信息。,菌种复活,：冷冻菌种的复活，无菌操作打开玻璃管，用相应的液体培养基溶解冷冻菌种，转移至适宜的培养基中复活。,确认：,用无菌接种环取复活的培养物，在相应的培养基平板上划线分离培养，观察典型的菌落形态，菌落形态的一致性，挑取单个菌落形态进行革兰氏染色、镜检，观察染色特性及微生物形态学特征，生化反应或用菌种鉴定系统进行进一步鉴定。,菌种的管理,保藏,-,确保在相应的保藏条件下的菌种不会变异且性能稳定，经济简便。,甘油冷冻保藏：,液体培养物加入等体积的,20%,甘油，混匀，分装于,1ml,的小管，,-80,-30保存；或菌苔刮取后分散于无菌水中，加入等体积20%,甘油的,TSB,中。再分装。,瓷珠保藏法,将培养好的微生物细胞或孢子制成悬浮液，转入装有无菌多孔玻璃珠（或瓷珠）的无菌瓶中，使其吸附于玻璃珠表面，去除多余悬浮液，低温冷冻保存的一种菌种保藏方法。,SN/T 2660-2010,食品微生物实验室菌种保藏方法：,-70,可保存,10,年,斜面低温保藏：,把待保藏菌接种在适宜的斜面培养基表面，充分生长后，在,4,左右冰箱保存。铜绿不能用此法保存。,菌种的管理,菌种的管理,传代：,工作菌株的传代次数不得超过,5,代（标准菌株为第,0,代）。,1,代是指将活的培养物接种到微生物生长的新鲜培养基中培养，任何形式的转种均被认为是传代,1,次。传代时，应对工作菌株的特性和纯度进行确认。,使用：,使用工作菌种制备菌液，做好记录。菌液制备后若在室温下放置，应在,2,小时内使用；若保存在,2-8,度，可在,24,小时内使用。,销毁：,传代、使用过程产生的所有活的微生物均应进行高压灭菌处理。,菌种的管理,菌种的标识,每一支菌种都应以适当的标签、标识来表示其名称、菌号、接种日期、代数等信息。,例如,1,：,大,CMCC(B)44102,标,140606/0/3,，其中“大”表示大肠埃希菌，“标”代表标准菌株，“,1,40606,”指标准菌株的购买日期即,2014,年,6,月,6,日，“,0,”代表是零代，“,3,”代表是一共购买,3,支。,例如,2,：大,CMCC(B)44102,储（瓷）,140606/2/10,，其中“大”表示大肠埃希菌，“储”代表标准储备菌株， “瓷”表示用瓷珠保藏法来保藏此菌种，“,140606,”指标准储备菌株的传代日期即,2014,年,6,月,6,日，“,10,”代表是一共制备了,10,支。,生物安全实验室,生物安全实验室简介,二级生物安全实验室的建设要求,生物安全柜的分类与特点,二级生物安全柜的使用,生物安全实验室,人间传染的病原微生物名录,根据微生物的危害程度将其分为,4,类，药品微生物检测所涉及到的菌都为第三类，应该在二级生物安全实验室操作。,具有一定的,生物安全防护水平,的实验室统称为生物安全实验室。,通过标准化的建筑、生物安全设备配置、个人防护、翔实的,SOP,和严格的管理来实现 。,生物安全实验室,气溶胶,aerosol,悬浮于气体介质中,粒径一般为 的固态或液态微小粒子形成的稳定的分散体系。,吸入 （病原微生物污染的空气）（气溶胶,m,的固态、液态微小粒子悬浮在气体介质中形成的相对稳定的分散体系）,感染性病原微生物气溶胶的吸入是造成实验室相关感染的主要因素。,生物安全实验室,二级生物安全实验室建设要求,（,1,）必须为实验室安全运行、清洁和维护提供足够的空间。在实验室的工作区外还应当提供另外的可长期使用的储存间。应当为安全操作及储存溶剂、放射性物质、压缩气体和液化气提供足够的空间和设施,.,在实验室的工作区外应当有存放外衣和私人物品的设施。在实验室的工作区外应当有进食、饮水和休息的场所,（,2,） 实验室墙壁、天花板和地板应当光滑、易清洁、不渗漏、耐化学品和消毒剂的腐蚀。地板应当防滑。实验台面应是防水的，并可耐消毒剂、酸、碱、有机溶剂和中等热度的作用。实验室器具应当坚固耐用，在实验台、生物安全柜和其他设备之间及其下面要保证有足够的空间以便进行清洁。实验室的门应有可视窗，并达到适当的防火等级，最好能自动关闭,(3),应保证实验室内所有活动的照明，避免不必要的反光和闪光。要有可靠和充足的电力供应和应急照明，以保证人员安全离开实验室。,生物安全实验室,(4),必须为实验室提供可靠和高质量的水。要保证实验室水源和饮用水源的供应管道之间没有交叉连接。应当安装防止逆流装置来保护公共饮水系统。每个实验室都应有洗手池，并最好安装在出口处，尽可能用自来水,.,(5),安全系统应当包括消防、应急供电、应急淋浴以及洗眼设施。应当配备具有适当装备并易于进入的急救区或急救室。,(6) BSL-2,实验室，应在靠近实验室的位置配备高压灭菌器或其他清除污染的工具。,(7),在设计新的设施时，应当考虑设置机械通风系统，以使空气向内单向流动。如果没有机械通风系统，实验室窗户应当能够打开，同时应安装防虫纱窗。,(8),必须考虑安全保卫措施。必须使用坚固的门、安全窗户以及门禁系统。适当时还应使用其他措施来加强安全保障。,生物安全实验室,生物安全实验室,防护要求,在实验室工作时，必须穿着合适的,工作服或防护服,。,在进行可能接触到血液、体液以及其他具有潜在感染性的材料或感染性动物的操作时，应戴上合适的手套。手套用完后，应先消毒再摘除，随后必须洗手。,在处理完感染性实验材料和动物后，以及在离开实验室工作区域前，都必须洗手。,为了防止眼睛或面部受到喷溅物的污染、碰撞或人工紫外线辐射的伤害，必须戴合适的安全眼镜、面罩（面具）或其他防护设备。,严禁穿着实验室防护服离开实验室工作区域。,不得在实验室内穿露脚趾的鞋。,禁止在实验室工作区域进食、饮水,、,吸烟、化妆和处理隐形眼镜。,禁止在实验室工作区域储存食品和饮料。,在实验室内用过的防护服不得和日常服装放在同一柜子内。,生物安全实验室,生物安全柜（,Biosafety Cabinet,BSC),负压过滤排风柜,在生物因子操作过程中用来保,护操作人员、环境和（或）实验材料，防止感染,性材料在实验中产生的气溶胶向操作者和环境扩,散。,生物安全实验室的重要设备，是病原微生物操作,的一级防护屏障，关系生命安全和环境安全，有,严格质量要求。,安全柜分级：,、,、,三个级别。,生物安全实验室,生物安全柜种类,BSC,有三个级别，一共有六种。,生物安全柜,正面气流速度（,m/s,）,气流重新循环部分（,%,）,气流排出部分（,%,）,排风系统,级,0.36,0,100,硬管,级,A1,0.38-0.51,70,30,排到房间或套管连接处,级,A2,0.51,70,30,排到房间或套管连接处,级,B1,0.51,30,70,硬管,级,B2,0.51,0,100,硬管,级,不适用,0,100,硬管,生物安全实验室,级生物安全柜,操作者可通过前窗操作口,在安全柜内进行操作。,前窗操作口向内吸入的负,压气流保护人员的安全。,污染气流经高效过滤器过,滤后排出，保护环境不受,污染。,不保护操作对象,。,A-,前窗操作口,B-,观察窗,C-,排气过滤器,D-,负压排气通路,级安全柜结构和气流模式示意图,生物安全实验室,级生物安全柜根据结构特点和气流模式,的不同分为,A1,、,A2,、,B1,、,B2,四种类型,操作者通过前窗操作口在安全柜内进行操作。,操作口流入气流：,保护人员,经高效过滤器过滤的下降气流：,保护产品,被污染气流经高效过滤器过滤后排出：,保护环境,生物安全实验室,A1,型,生物安全柜,前窗操作口流入气流的最低速率为；,下降气流为部分流入气流和部分循环气流的混合,气流，经高效过滤器过滤后送至工作区；,污染气流经过高效过滤器过滤后可以排到实验室,中或经安全柜的外接排风管道排到大气中；,安全柜内的,污染部位可以处于正压状态,；,A1,型安全柜不能用于挥发性有毒化学品和挥发性,放射性核素的实验。,生物安全实验室,II,A1,型生物安全柜,70%,气体循环利用,30%,气体外排,.,环境空气,污染的空气,HEPA,过滤的空气,負,压的污染空气,生物安全实验室,操作口流入气流的最低速率为；,下降气流为部分流入气流和部分循环气流的混合,气流，经高效过滤器过滤后送至工作区；,污染气流经过高效过滤器过滤后可以排到实验室,或经安全柜的外接排风管道排到大气中；,安全柜内,所有污染部位均处于负压状态或者被负,压通道和负压通风系统环绕,；,安全柜用于进行以微量挥发性有毒化学品和痕量,放射性核素为辅助剂的微生物实验时，必须连接,功能合适的排气罩。,生物安全实验室,II,A2,型生物安全柜,70%,气体循环使用,.,30%,气体排出，既可以接管道外排，也可以不接管道直接排放在实验室,环境空气,污染的空气,HEPA,过滤的空气,污染空气,生物安全实验室,级,B1,型生物安全柜,操作口流入气流的最低速率为；,下降气流大部分由未污染的流入气流循环提供,，,经过高效过滤器过滤后送至工作区；,大部分,被污染的下降气流经过高效过滤器过滤后,通过专用的排气管道排入大气中,；,安全柜内所有被污染部位均处于负压状态或者被,负压通道和负压通风系统包围；,如果挥发性有毒化学品或放射性核素随空气循环,不影响实验操作或实验在安全柜的直接排气区域,进行，,B1,型安全柜可以用于以微量挥发性有毒化,学品和痕量放射性核素为辅助剂的微生物实验,生物安全实验室,级,B2,型生物安全柜,前窗操作口流入气流的最低速率为；,下降气流来自经过高效过滤器过滤的实验室或室,外空气,(,即流经样本后的气体不再循环使用,),；,流入气流和下降气流经过高效过滤器过滤后通过,专用排气管道排到大气中，不允许回到安全柜和,实验室中,；,所有污染部位均处于负压状态，,污染气体过滤后,被全部外排（不在工作区循环）,；,B2,型安全柜可以用于以挥发性有毒化学品和放射,性核素为辅助剂的微生物实验。,生物安全实验室,级生物安全柜,具有全封闭、不泄漏结构的通风柜；,人员通过与柜体连接的密闭手套在安全柜内实施,操作；,安全柜内对实验室的负压应不低于,120Pa,；,下降气流经高效过滤器过滤后进入安全柜；,排出气流一般经两道高效过滤器过滤。,生物安全实验室,生物安全柜的放置,放置生物安全柜的实验室，电压必须稳定，电流大于,14A,远离门和窗,与墙壁有,30cm,的间距,预留出空间连接管道，外接的排气口要比楼层高,2,米,A/B3,型和,B2,型安全柜要放置在专用房间,定好仪器后再确定施工方案,生物安全实验室,生物安全柜的使用,1,、检查生物安全柜性能,开启生物安全柜电源，打开开关，检查生物安全柜的正常性能指标，确保气流量、风速、负压均在正常范围内，将生物安全柜的玻璃门移到安全范围内，若超出安全范围，安全柜的报警器会发出报警，应及时调整。,生物安全实验室,生物安全柜的使用,2,、准备,将所有实验用品转移到生物安全柜内，并合理布置。,布置时遵循以下原则：,安全柜内所有的材料放在离开安全柜前面的格栅和后面工作台面的边缘尽可能远的位置，不得堵塞正面、侧面或后面的回风口。,通常清洁物置于左侧，污染物置于右侧，中间进行操作。装有生物危害性废弃物容器,/,袋、盛放废弃移液管的盘子及吸滤瓶等体积较大的物品，应该放在生物安全柜内的右侧。,如有容易产生气溶胶的设备时，应该靠近安全柜的后部放置。,在安全柜的工作台面上应放置消毒液浸泡过的毛巾或纱布或一次性灭菌台布，以便进行常规清洁和感染性物质溢洒时的处理。,生物安全实验室,生物安全柜的使用,3,、净化,工作开始前，至少让安全柜运行,5min,来完成“净化”的过程。,4,、,实验,调整好坐椅高度，操作者移动双臂进入安全柜，等待大约一分钟，开始对物品进行处理。,生物安全实验室,生物安全柜的使用,在生物安全柜内操作时应遵循以下原则：,安全柜的玻璃观察挡板必须置于规定的打开高度范围内。,安全柜内不能使用明火（如酒精灯）。,在生物安全柜里操作时，不能进行文字工作。,允许使用微型电加热器，最好使用一次性无菌接种环。,所有工作应该在距离前面格栅,10 cm,的工作台面上进行，并能够通过玻璃观察挡板看到。,操作者必须按照生物安全实验室规定穿着好防护衣物及手套进行操作。避免皮肤在生物安全柜内暴露，尽可能避免手和手臂被微生物污染。,生物安全实验室,生物安全柜的使用,在生物安全柜内操作时应遵循以下原则：,操作者手臂应垂直于安全柜的操作口，避免横放在前面的格栅上，以免阻挡排风。手臂进出时缓慢移动，并尽可能避免横向移动。在手臂进出安全柜或手臂在安全柜前操作口大范围移动时，需稳定大约,1,分钟后，才能进行实验操作。,操作者应尽量减少手臂移出和伸进安全柜的次数，以免干扰气流。,生物安全实验室,生物安全柜的使用,在生物安全柜内操作时应遵循以下原则：,生物安全柜内发生溢洒时，应在生物安全柜处于工作状态下立即进行清理，要使用有效的消毒剂擦拭或覆盖，并在处理过程中尽可能减少气溶胶的生成，具体操作详见“微生物实验室生物危害应急程序”。,实验中所产生的废弃物应放入专用的废物器皿中。,若一次性手套污染严重或发生破损，应及时更换外层手套。保持手套的清洁度。,尽量减少操作者身后的人员活动。,生物安全实验室,生物安全柜的使用,5,、清场,实验完毕，密闭所有试剂瓶，盖好装有未用完清洁,Tip,头、清洁玻璃器皿、待培养平皿（瓶）等实验材料的容器盖，并用消毒剂消毒容器外表面，扎好装有待消毒废料的塑料袋口，等待,2,3,分钟后，先移出主要实验物品，再移出剩余实验物品。将需要传出实验室的物品通过传递窗传出。,生物安全实验室,生物安全柜的使用,清理安全柜内物品时应遵循以下原则：,所有物品取出安全柜之前需要进行表面消毒处理（一般为,70%,乙醇）。,所有实验废物均应收集到污物袋中或废物收集器皿中，污物袋需包扎后移出安全柜，废物器皿需要盖上盖再移出安全柜。,所有敞口托盘、容器盖好盖后，所有口袋封口后再移出安全柜。,生物安全实验室,6,、消毒,用消毒剂（一般为,70%,乙醇或漂白溶液）对工作台面和生物安全柜内表面进行擦拭消毒。擦拭时应无遗漏，无死角。若使用漂白剂等腐蚀性消毒剂后，还必须用无菌水再次进行擦拭清洁。,打开紫外线灯照射,15-30,分钟后，关闭紫外线灯。,关闭送风按钮，关闭安全柜电源开关。,谢 谢！,The End,谢谢您的聆听！,期待您的指正！,