实验三 病原细菌鉴定与药物敏感性

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,实验三 病原细菌鉴定与药物敏感性,2,二、实验内容,1.,平板划线法分离病原细菌；,2,病原细菌的形态与生理生化鉴定；,3,病原细菌的人工感染（课外选作实验）。,3,三、主要仪器及试材,显微镜，解剖镜，解剖用具，包括解剖盘、解剖刀、解剖针、大小手术剪、大小镊子，培养皿、载玻片、盖玻片、纱布等。,蒸馏水、鱼用生理盐水，,70%,的乙醇、,BHI,培养基、生化管等。,人工感染嗜水气单胞菌的鱼，未知病原菌感染的鱼,（剪掉部分背鳍或腹鳍作为标记,),。,4,四、实验方法与步骤,（一） 病原细菌的分离,1,无菌操作打开病鱼的腹腔：,2,细菌划线接种：,3,培养与观察：,（二）病原细菌的革兰氏染色,分别取嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、链球菌和个人分离的未知菌株进行革兰氏染色，记录结果。,5,四、实验方法与步骤,（三）病原细菌的生理生化鉴定,分别测定,分离菌,和,嗜水气单胞菌,的,12,种生化指标：氧化酶，吲哚实验，,VP,，,H,2,S,，鸟氨酸脱羧酶，精氨酸双水解酶性，七叶苷，赖氨酸脱羧酶，山梨醇，蔗糖，纤维二糖，明胶。,取生化管于距离内容物上方,2cm,处用砂轮割开，迅速于酒精灯火焰消毒，然后接种菌株，以,封口膜,或液体石蜡封口，置,35,孵育，依据说明书进行。,6,四、实验方法与步骤,（四）病原细菌的毒力分析,1,实验鱼：,实验环境下暂养,7-10,天。每组不少于,50,条,，设不少于,3,个平行重复。,2,菌悬液制备：,液体培养基增殖，用无菌生理盐水悬浮。经计数后采用等对数间距设计约,5,个感染剂量,进行感染试验。对照组以无菌生理盐水。,3,注射方法：,感染前实验鱼用,MS-222,麻醉，用湿毛巾裹住鱼体头部。,（,1,）腹腔注射：腹鳍基部无鳞片处。,（,2,）肌肉注射：背鳍前端与侧线之间的中部区域。,7,四、实验方法与步骤,（四）药物敏感性实验,（一）纸片扩散法,1.,原理：,含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成,递减的浓度梯度,，细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，即抑菌圈愈大，药物敏感性越强。,8,四、实验方法与步骤,2.,实验操作,1,）倒平板,2,）菌悬液制备：,挑取斜面中菌苔于少量生理盐水中制成细菌悬液，将菌液浓度调到,1*107 cfu/mL,。以玻璃刮铲将细菌悬液均匀涂布于平皿培养基表面；,3,）贴片：,将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了能准确观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上（在平皿中均匀贴四片）；,4,）培养：,28,温箱中培养,24 h,，记录结果；,9,四、实验方法与步骤,结果观察：抑菌圈直径大小与药物浓度、细菌浓度有直接关系，观察抑菌圈的有无。若有抑菌圈，则测量抑菌圈直径；若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。,抑菌圈直径,15mm,高度敏感,抑菌圈直径,10-15mm,中度敏感,抑菌圈直径,10mm,低度敏感,无抑菌圈 不敏感或耐药,氟：,75,g/mL,；恩：,5,g/mL,磺：,300,g/mL,；青：,10IU/mL,10,标记分区,底部观,磺,氟,靑,嗯,12,四、实验方法与步骤,（二）肉汤试管稀释法,1.,原理：,以肉汤液体培养基将抗生素作不同浓度的稀释，然后接入待检菌，定量测定抗菌药物对被测菌的最低抑菌浓度（,MIC,）。,2.,实验操作,1,）菌液准备：,挑取金黄色葡萄球菌斜面中的菌苔于少量生理盐水中制成细菌悬液，将菌液浓度调到,1*107cfu/mL,备用；,13,四、实验方法与步骤,2,）抗菌药物稀释（硫酸庆大霉素注射液）：,配制药物原液浓度为,8,万,IU/mL,（,80mg/mL,），,0.45,m,滤器除菌。,准备,11,支,2 mL,无菌,EP,管编号,010,排好，在,0,号管和,1,号管中加,1.8 mL,无菌生理盐水，,210,号管加,1 mL,；,吸取,0.2 mL,药原液加入第一支,EP,管中混匀，从第一支试管中吸取,0.2 mL,加入第二支,EP,管混匀，然后吸取,1 mL,加入第三支混匀,以此类推，直到第十一支；,取,12,支灭过菌的玻璃试管编号,1-12,排好，各加入灭过菌的培养液，然后从编号相对应的,EP,管中吸取稀释过的药液再做,10,倍比稀释。,14,四、实验方法与步骤,3,）接种：,每只试管中加入的菌液；,4,）培养：,置,37,温箱，培养,24h,；,5,）结果观察：,肉眼观察，以不出现肉眼可见生长的最低药物浓度为该药对测试菌的,MIC,。,根据结果换算出最小抑菌浓度（,g/mL,）。,8000 800 400 200 100 50 25 12.5 6.25 3.12,1.56 0.78,无菌生理盐水,1.8mL,0.2mL,抗生素,8,万,/mL,下排培养液每管,1.8mL,对应加,0.2mL,80 40 20 10 5 2.5 1.25 0.6 0.3,0.15 00.8,16,五、实验注意事项,分离、接种时严格按照无菌操作要求进行。,革兰氏染色过程中涂片务求均匀，切忌过厚，染色过程中不可使染液干涸。,药敏实验，在贴片时用无菌镊子轻轻触压药物纸片，使之与培养基充分接触，贴片后不能再更改纸片位置；镊取药物纸片时一旦掉到培养基表面，则继续保持其位置，切勿镊起重新放置，以防不同抗生素交叉影响。,17,六、实验安排,1-4,节,(1),配培养基（固体、液体分装），包培养皿（,10,包），配制生理盐水，灭菌（,4,瓶）；,(2),完成细菌染色、观察和生化指标测定；,4-8,节,(1),倒平板接种贴纸；,(2),药液稀释接种；（,3,）第二天早上看结果。,18,七、实验报告（一）,1,记录菌落特征、细菌形态、染色结果和生理生化结果（,30,分）。,2,，据细菌形态特征和生化指标初步鉴定分离自患病鱼的细菌种类（,20,分）。,3,，如何设计试验来验证你的细菌鉴定结果（,30,分）。,19,七、实验报告（二）,1,记录你所测细菌的药敏实验结果并分析（,40,分）。,2,假如你是水产执业兽医师，请根据你所分离的细菌鉴定和药敏实验结果，开出你的用药处方，并简要阐述理由（,60,分）。,谢谢大家！,结 语,