还原糖的测定分析

,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,2020/11/3,*,Click to edit Master title style,LOGO,碳水化合物的测定,2020/11/3,1,1,概述,2,食品中还原糖的测定,3,总糖的测定,4 淀粉的测定,5 纤维的测定,6 果胶物质的测定,2020/11/3,2,1 概述,1.1 碳水化合物分类,1.2 测定方法,1.3 可溶性糖类的提取和澄清,2020/11/3,3,(一）定义和分类,碳水化合物统称为糖类，是由碳、氢、氧三种元素组成的一大类化合物。,糖+蛋白质糖蛋白,糖+脂肪糖脂, 碳水化合物存在于各种食品的原料中（特别是植物性原料中）。, 作为食品工业的主要原料和辅助材料。,1.1 碳水化合物分类,2020/11/3,4, 在各种食品中存在形式和含量不一。,糖分为单糖、双糖、多糖。,有效碳水化合物人体能消化利用的单糖、双糖、多糖中的淀粉。,无效碳水化合物多糖中的纤维素、半纤维素、果胶等不能被人体消化利用的。,这些无效碳水化合物能促进肠道蠕动。,2020/11/3,5,碳水化合物,单糖,双糖,多糖,葡萄糖,果糖,半乳糖,蔗糖,乳糖,麦芽糖,淀粉,纤维素,果胶,有效碳水化合物,无效碳水化合物,2020/11/3,6,1.2 测定方法,单糖和低聚糖,物理法,化学法,色谱法：,纸色谱法、薄层色谱法、,酶法,相对密度法,折光法,旋光法,还原糖法（斐林氏法、高锰酸钾法、铁氰化钾法）,碘量法,缩合反应法,多 糖,淀粉,：水解为单糖，再用单糖测定方法测定,果胶和纤维素：,多采用重量法,2020/11/3,7,食品中糖类物质的测定方法,相对密度法,折光法,旋光法,物理法, 物理法, 化学法, 色谱法, 发酵法, 酶 法, 重量法,2020/11/3,8,直接滴定法法,(改良的兰爱农法）,高锰酸钾法,萨氏法,铁氰化钾,3，5二硝基水杨酸,酚硫酸法,蒽酮法,半胱氨酸咔唑法,化学法,还原糖法,碘量法,比色法,2020/11/3,9,纸色谱,薄层色谱,GC,HPLC,酶,-,比色法；酶,-,电极法（测葡萄糖）,酶水解测淀粉,重量法测果胶、纤维素、膳食纤维素,电泳法，生物传感器,色谱法,酶法,2020/11/3,10,常用的提取剂有,水（,4050,）,乙醇,溶液,（除蛋白，淀粉；回流提取）,，,取样量和稀释倍数的确定，,提取经净化和可能的转化后，每毫升含糖量应在,0,.,5,3.5mg,之间，,1.3 可溶性糖类的提取和澄清,(1) 提取液的制备,2020/11/3,11,含脂肪的食品，,通常需经脱脂再提取。, 含大量淀粉和糊精的食品，,宜采用70,75%乙醇溶液提取。, 含酒精和,二,氧化碳的液体样品，蒸发除去酒精和二氧化碳。,酸性,食品,，预先用氢氧化钠调节样品溶液至中性，以防止低聚糖被部分水解。,2020/11/3,12,（,2,）提取液的澄清,能较完全地除去干扰物质；,不吸附或沉淀被测糖分，也不改变被测糖分的理化性质；,过剩的澄清剂应不干扰后面的分析操作，易于除掉。,常用三种澄清剂：,中性醋酸铅,Pb（CHCOO),2,3H,2,O,乙酸锌和亚铁氰化钾溶液,硫酸铜和氢氧化钠溶液,作为澄清剂必需具备以下几点要求,：,2020/11/3,13,用量必须适当，太少，达不到澄清的目的,太多，会使分析结果产生误差。,（,3,）澄清剂的用量,2020/11/3,14,二、 还原糖的测定,根据糖分的还原性的测定方法叫还原糖法。,直接滴定法（,GB,法）,（1） 原理：将一定量的碱性酒石酸铜甲、乙液等量混合，立即生成天蓝色的氢氧化铜沉淀；,这种沉淀很快与酒石酸钾反应，生成深蓝色的可溶性酒石酸钾钠铜络合物。,在加热条件下，以次甲基蓝作为指示剂，用样液滴定，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，生成红色的氧化亚铜沉淀；,这种沉淀与亚铁氰化钾络合成可溶的无色络合物；二价铜全部被还原后，稍过量的还原糖把次甲基蓝还原，溶液由兰色变为无色，即为滴定终点；,根据样液消耗量可计算出还原糖含量。,2020/11/3,15,（,2）适用范围及特点,本法又称快速法，它是在蓝一爱农容量法基础上发展起来的，其特点是试剂用量少，操作和计算都比较简便、快速，滴定终点明显。,适用于各类食品中还原糖的测定。但测定酱油、深色果汁等样品时，因色素干扰，滴定终点常常模糊不清，影响准确性。,本法是国家标准分析方法。,2020/11/3,16,（3）试剂, 碱性酒石酸铜甲液：硫酸铜+次甲基蓝, 碱性酒石酸铜乙液：酒石酸钾钠 +,NaOH +,亚铁氰化钾, 乙酸锌溶液, 亚铁氰化钾溶液, 葡萄糖标准溶液：准确称取经 98 100 干燥至恒重的无水葡萄糖，加水溶解后移入1000,m1,容量瓶中，加入5,m1,盐酸(防止微生物生长)。,澄清剂,2020/11/3,17,样品处理,取适量样品，按本章第二节中的原则对样品进行提取，提取液移入250,m1,容量瓶中，慢慢加入 5,m1,乙酸锌溶液和 5,m1,亚铁氰化钾溶液，加水至刻度，摇匀后静置 30分钟。用于燥滤纸过滤，弃初滤液，收集滤液备用。,（,4,）测定方法,2020/11/3,18,碱性酒石酸铜溶液的标定,准确吸取碱性酒石酸铜甲液和乙液各 5,ml，,置于250,ml,锥形瓶中，加水10,ml，,加玻璃珠3粒。从滴定管滴加约9,ml,葡萄糖标准溶液，加热使其在2分钟内沸腾，准确沸腾30秒钟，趁热以每2秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。,记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积。平行操作3次，取其平均值。,2020/11/3,19,m,1,= V,F10ml,碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄 糖的质量,mg;,葡萄糖标准溶液的浓度,mgml；,V,标定时消耗葡萄糖标准溶液的总体积，,ml。,也可不标定，直接查表求,值。,2020/11/3,20,样品溶液预测,吸取碱性洒石酸铜甲液及乙液各5.00,ml，,置于250,m1,锥形瓶中，加水10,ml,加玻璃珠3粒，加热使其在2分钟内至沸，准确沸腾30秒钟，趁热以先快后慢的速度从滴定管中滴加样品溶液，滴定时要始终保持溶液呈沸腾状态。待溶液蓝色变浅时以每2秒1滴的速度滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。记录样品溶液消耗的体积。,2020/11/3,21,样品溶液测定 吸取碱性洒石酸铜甲液及乙液各 5.00,ml，,置于250,ml,锥形瓶中，加玻璃珠3粒，从滴定管中加入比预测时样品溶液消耗总体积少1,ml,的样品溶液，加热使其在2分钟内沸腾，准确沸腾30秒钟，趁热以每2秒1滴的速度继续滴加样液，直至蓝色刚好褪去为终点。 记录消耗样品溶液的总体积。同法平行操作3份，取平均值。,2020/11/3,22,（,5,）计算结果,2020/11/3,23, 此法测得的是总还原糖量。, 在样品处理时，不能用铜盐作为澄清剂，以免样液中引入,Cu,2+,，,得到错误的结果。, 碱性酒石酸铜甲液和乙液应分别贮存，用时才混合，否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低。,（,6,）说明与讨论,2020/11/3,24, 滴定必须在沸腾条件下进行，其原因一是可以加快还原糖与,Cu,2+,的反应速度；二是次甲基蓝变色反应是可逆的，还原型次甲基蓝遇空气中氧时又会被氧化为氧化型。此外，氧化亚铜也极不稳定，,易被空气中氧所氧化。保持反应液沸腾可防止空气进入，避免次甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加耗糖量。,2020/11/3,25,滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源上取下来滴定，以防止空气进入反应溶液中。,样品溶液预测的目的；一是本法对样品溶液中还原糖浓度有一定要求(0.1%左右)，测定时样品溶液的消耗体积应与标定葡萄糖标准溶液时消耗的体积相近，通过预测可了解样品溶液浓度是否合适，浓度过大或过小应加以调整，使预测时消耗样液量在 10,ml,左右；,2020/11/3,26,通过预测可知道样液大概消耗量，以便在正式测定时，预先加入比实际用量少 1,ml,左右的样液，只留下 1,ml,左右样液在续滴定时加入，以保证在 1 分钟内完成续滴定工作，提高测定的准确度。,影响测定结果的主要操作因素是反应液碱度、热源强度、煮沸时间和滴定速度。反应液的碱度直接影响二价铜与还原糖反应的速度、反应进行的程度及测定结果。,2020/11/3,27,在一定范围内，溶液碱度愈高，二价铜的还原愈快。因此，必须严格控制反应液的体积，标定和测定时消耗的体积应接近，使反应体系碱度一致。,热源一般采用 800,w,电炉，电炉温度恒定后才能加热，热源强度应控制在使反应液在两分钟内沸腾，且应保持一致。否则加热至沸腾所需时间就会不同，引起蒸发量不同，使反应液碱度发生变化，从而引入误差。,2020/11/3,28,沸腾时间和滴定速度对结果影响也较大,一般沸腾时间短，消耗糖液多。反之，消耗糖液少,滴定速度过快，消耗糖量多，反之，消耗糖量少。,因此，测定时应严格控制上述实验条件，应力求一致。,2020/11/3,29,GB/T 5009.72008,食品中还原糖的测定,1.直接滴定法,2.高锰酸钾法,2020/11/3,30,(二)高锰酸钾滴定法,1,.,原理,将一定量的样液与一定量过量的碱性酒石酸铜溶液反应，还原糖将二价铜还原为氧化亚铜，,过滤氧化亚铜沉淀，加入过量的酸性硫酸铁溶液将其氧化溶解，而三价铁盐被定量地还原为亚铁盐，,用高锰酸钾标准溶液滴定亚铁盐，根据高锰酸钾溶液消耗量可计算出氧化亚铜的量,再查检索表,得到氧化亚铜量相当的还原糖量，即可计算出样品中还原糖含量。,2020/11/3,31,2适用范围及特点（,GB2008,）,本法是国家标准分析方法，适用于各类食品中还原糖的测定，有色样液也不受限制。方法的准确度高，重现性好，准确度和重现性都优于直接滴定法。但操作复杂、费时，需使用特制的高锰酸钾法糖类检索表。,2020/11/3,32,1. 碘量法,(1) 原理,样品经处理后，取一定量样液于碘量瓶中，加入一定量过量的碘液和过量的氢氧化钠溶液，样液中的醛糖在碱性条件下被碘氧化为醛糖酸钠,由于反应液中碘和氢氧化钠都是过量的，两者作用生成次碘酸钠残留在反应液中，当加入盐酸使反应液呈酸性时，过量碘析出,用硫代硫酸钠标准溶液滴定析出的碘，则可计算出氧化醛糖消耗的碘量，从而计算出样液中醛糖的含量。,(四)其他方法简介,2020/11/3,33,碘量法,碱性溶液中，糖的醛基被碘氧化为糖酸,醛基糖,+I,2,-,糖酸,+I,-,I,2,（过量）,+NaS,2,O,3,-,常用于葡萄糖和果糖共存时，二者各自的定量。,Fru-,先用碘量法反应掉葡萄糖，在直接滴定果糖,2020/11/3,34,酶比色法,GOD,-D-,葡萄糖,(,溶液,)D-,葡萄糖酸,-,内酯,+H,2,O,2,POD,H,2,O,2,+4-,氨基安替比林,+,苯酚, ,红色醌亚胺（,505nm,）,计算食品中葡萄糖的含量（仲裁法）,酶电极法,GOD,-D-,葡萄糖,(,溶液,)D-,葡萄糖酸,-,内酯,+H,2,O,2,H,2,O,2,（电极电流）,正比于葡萄糖浓度（直接读数）,2020/11/3,35,三、蔗糖的测定,蔗糖是葡萄糖和果糖组成的双糖，没有还原性，不能用碱性铜盐试剂直接测定,在一定条件下，蔗糖可水解为具有还原性的葡萄糖和果糖（转化糖）。因此，可以用测定还原糖的方法测定蔗糖含量。,对于纯度较高的蔗糖溶液，其相对密度、折光率、旋光度等物理常数与蔗糖浓度都有一定关系，故也可用物理检验法测定。这里介绍还原糖法。,2020/11/3,36,1原理,样品脱脂后，用水或乙醇提取，提取液经澄清处理以除去蛋白质等杂质，,用盐酸进行水解，使蔗糖转化为还原糖。,分别测定水解前后样品液中还原糖含量，两者差值即为由蔗糖水解产生的还原糖量，乘以一个换算系数即为蔗糖含量。,2020/11/3,37,2. 试剂：用 0.1转化糖标准溶液标定斐林试剂。,3,.,测定方法,取一定量样品，按直接滴定法或高锰酸钾滴定法中的样品处理方法处理，吸取处理后的样液2份各50,ml，,分别放入,l00ml,容量瓶中，一份加入5,ml 6molL,盐酸溶液，置68,-70,水浴中加热15分钟，取出迅速冷却，加2滴甲基红，用,NaOH,溶液中和至中性，加水至刻度，混匀。另一份直接用水稀释到100,m1。,然后按直接滴定法或高锰酸钾滴定法测定还原糖含量。,2020/11/3,38,GB/T 5009.82008,食品中蔗糖的测定,HPLC,法（第一法）,酸水解法（第二法）,2020/11/3,39,四、总糖的测定,食品中的总糖通常是指具有还原性的糖(葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽等)和在测定条件下能水解为还原性单糖的蔗糖的总量。,总糖是食品生产中常规分析项目。它反映的是食品中可溶性单糖和低聚糖的总量，其含量高低对产品的色、香、味、组织形态、营养价值、成本等有一定影响。,2020/11/3,40,总糖是麦乳精、糕点、果蔬罐头、饮料等许多食品的重要质量指标。,总糖的测定以还原糖的测定方法为基础的，常用的,直接滴定法（国标），,蒽酮比色法。,直接滴定法,原理,:,样品经处理除去蛋白质等杂质后,在加热条件下盐酸使蔗糖水解为还原性单糖，以直接滴定法测定水解后样品中的还原糖总量。,2020/11/3,41,说明与讨论,总糖测定结果一般以转化糖计，但也可以以葡萄糖计，要根据产品的质量指标要求而定。如用转化糖表示，应该用标准转化糖溶液标定碱性酒石酸铜溶液，如用葡萄糖表示，则应该用标准葡萄糖溶液标定。,在营养学上，总糖是指能彼人体消化、吸收利用的糖类物质的总和，包括淀粉。这里所讲的总糖不包括淀粉，因为在测定条件下，淀粉的水解作用很微弱。,2020/11/3,42,蒽酮比色法,原理,单糖,+,浓硫酸时,脱水生成糠醛衍生物,糠醛衍生物,+,蒽酮,缩合成蓝绿色的化合物，,当糖的量在20一200,mg,范围内时其呈色强度与溶液中糖的含量成正比，故可比色定量。,2020/11/3,43,五、可溶性糖类的分离与定量,主要方法：,1. 纸色谱法分离效果差，操作时间长。,2.,GC,法糖不易挥发。,3. 薄层色谱法（,TLC）,问题同纸色谱法。,4.,HPLC,法特别是离子色谱法（,IC,法）用高性能阴离子交换柱。,2020/11/3,44,三、淀粉的测定,淀粉是一种多糖。它广泛存在于植物的根、茎、叶、种子等组织中，是人类食物的重要组成部分，也是供给人体热能的主要来源。,淀粉是由葡萄糖单位构成的聚合体，按聚合形式不同，可形成两种不同的淀粉分子直链淀粉和支链淀粉。,2020/11/3,45,淀粉的主要性质如下：, 水溶性：直链淀粉不溶于冷水，可溶于热水，支链淀粉常压下不溶于水。只有在加热并加压时才能溶解于水。, 醇溶性：不溶于浓度在30以上的乙醇溶液。, 水解性：在酸或酶的作用下可以水解，最终产物是葡萄糖。, 旋光性：淀粉水溶液具有右旋性,为(+)201.5,-205,。, 与碘有呈色反应（是碘量法的专属指示剂）,2020/11/3,46,稳定剂雪糕、冷饮食品,增稠剂肉罐头,胶体生成剂,保湿剂,乳化剂,粘合剂,填充料糖果,淀粉的作用,2020/11/3,47,淀粉的测定方法有多种，根据淀粉的理化性质而建立的。常用的方法有：,酶水解法（国标,2008,第一法）,酸水解法 （国标,2008,第二法）,旋光法,重量法,酶比色法,2020/11/3,48,、酸水解法（一） 原理,预处理：乙醚除去脂肪，乙醇（,85%,）除去可溶性糖类后,酸解：用盐酸水解淀粉为葡萄糖,测定：按还原糖测定方法测定还原糖含量，再折算为淀粉含量（*,0.9,）。,（二）适用范围及特点,此法适用于淀粉含量较高，而半纤维素等含量较少的样品。该法操作简单、应用广泛，但选择性和准确性不及酶法。,2020/11/3,49,酸水解,淀粉,HCl(5%),100,，,2h,葡萄糖,回流装置,水解后调制中性,（防止生成糠醛聚合体）,2020/11/3,50,二、酶水解法,（一） 原理,含淀粉 糊精、麦芽糖 样品,葡萄糖,酸解,液化,过滤除纤维等,60,（,、,淀粉酶）,有选择性,加碘不变蓝,2020/11/3,51,（二）适用范围及特点,因为淀粉酶只水解淀粉不水解其他多糖，水解后通过过滤可除去其他多糖。,所以该法不受半纤维素等多糖的干扰，适合于这类多糖含量高的样品，分析结果准确可靠，但操作复杂费时。,2020/11/3,52,（三）说明与讨论,酶水解开始要使淀粉糊化，将烧杯置沸水浴上加热15分钟，使放冷至60 以下，加酶在55,-60,保温1小时，并不时搅拌。,取1滴此液于白色点滴板上，加1滴碘液应不呈蓝色，若呈蓝色，再加热糊化，冷却至60,以下，再加20,m1,淀粉酶溶液，继续保温，直至酶解液加碘液后不呈蓝色为止，加热至沸使酶失活，冷却后移入250,m1,容量瓶中，加水定容、过滤，弃去初滤液，收集滤液备用。,2020/11/3,53,三、其它方法,（一）旋光法,1,.,原理,淀粉具有旋光性，在一定条件下旋光度的大小与淀粉的浓度成正比。,氯化钙提取淀粉（煮沸，形成络合物提高淀粉溶解性）,SnCl,2,沉淀蛋白质,测定旋光度，即可计算出淀粉含量。,公式,2,.,适用范围及待点,本法适用于淀粉含量较高，而可溶性糖类含量很少的谷类样品，如面粉、米粉等。操作简便、快速。,2020/11/3,54,（二）重量法,（三）酶比色法（,AGS-GOD-POD),（四）蒽酮法,(,酸解,-,测总糖）,2020/11/3,55,GB/T 5009.882008,食品中膳食纤维的测定,GB/T 5009.102003,植物类食品中粗纤维的测定 酸碱处理法,粗纤维和膳食纤维测定,2020/11/3,56,四、粗纤维和膳食纤维的测定,粗纤维是植物性食品的主要成分之一，广泛存在于各种植物体内。化学上不是单一组分，是混合物。,1. 粗纤维主要成分是纤维素、半纤维素、木质素及少量含,N,物。集中存在于谷类的麸、糠、秸杆、果蔬的表皮等处。,对稀酸、稀碱难溶，人体不能消化利用的部分。,2020/11/3,57,纤维素构成植物细胞壁的主要成分，是葡萄糖聚合物，由,1，4,糖苷键连接，人类及大多数动物利用它的能力很低。不溶于水，但能吸水。,半纤维素一种混合多糖，不溶于水而溶于碱、稀酸加热比纤维素易水解，水解产物有木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖等。,2020/11/3,58,木质素不是碳水化合物，是一种复杂的芳香族聚合物，是纤维素的伴随物。难以用化学手段或酶法降解，在个别有机溶剂中缓慢溶解。,2020/11/3,59,膳食纤维(食物纤维) 它是指食品中不能被人体消化酶所消化的多糖类和木质素的总和。它包括纤维素、半纤维素、戊聚糖、本质素、果胶、树胶等，,膳食纤维比粗纤维更能客观、准确地反映食物的可利用率，因此有逐渐取代粗纤维指标的趋势。,膳食纤维测定,2020/11/3,60,2020/11/3,61,蛋白酶、淀粉酶、葡萄糖苷酶酶解,除去蛋白质，淀粉,乙醇沉淀,干燥残渣,总膳食纤维残渣,热水洗涤，过滤,残渣,不溶性膳食纤维残渣,滤液用乙醇沉淀，得可溶性膳食纤维残渣,称重后、扣除蛋白、灰分含量，得含量,称重后、扣除蛋白、灰分含量，得含量,称重后、扣除蛋白、灰分含量，得含量,2020/11/3,62,（二）粗纤维的测定,(,1,）称量法,1.原理,热的稀硫酸作用下，样品中的糖、淀粉、果胶等物质经水解而除去,热的氢氧化钾处理，使蛋白质溶解、脂肪皂化而除去,乙醇和乙醚处理以除去单宁、色素及残余的脂肪,残渣即为粗纤维，如其中含有无机物质，可经灰化后扣除。,2020/11/3,63,2适用范围及特点,该法操作简便、迅速，适用于各类食品，是应用最广泛的经典分析法。该法测定结果粗糙，重现性差。,由于酸碱处理时纤维成分会发生不同程度的降解，使测得值与纤维的实际含量差别很大，这是此法的最大缺点。,2020/11/3,64,五、果胶物质的测定,1. 概述,果胶物质由半乳糖醛酸、乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸等组成的高分子聚和物，一种植物胶。平均分子量达530万。存在于果蔬类植物组织中，是构成植物细胞的主要成分之一。,果胶物质的三种形态：原果胶、果胶酯酸、果胶酸。,2. 测定果胶的方法有：称量法、咔唑比色法、果胶酸钙滴定法、蒸馏滴定法。,2020/11/3,65,