核酸药物及制药技术

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/12/1,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/12/1,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/12/1,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/12/1,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/12/1,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/12/1,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/12/1,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/12/1,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/12/1,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/12/1,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/12/1,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,核酸药物及制药技术,反义核酸,反义,RNA,分子,： 可以和目标基因的,mRNA,互补的,一段寡聚核苷酸分子,，它影响,mRNA,正常功能；,反义,DNA,分子：,类似于反义,RNA,分子，可以,抑制基,因表达,的分子；,RNA-DNA,嵌合分子：,经化学修饰的寡聚核苷酸类似物,：,Oligo,反义核酸,2,2020/12/1,作用机理,与前体,RNA,结合干扰,RNA,剪切和成熟,与,mRNA,结合，封闭核糖体结合位点，影响翻译,与,mRNA,形成,dsRNA,，诱导,RNase H,对其降解,与互补,DNA,结合，形成,DNA-RNA,复合物，,影响,DNA,复制,3,2020/12/1,特点,双链,RNA,（如,siRNA,）作用强烈；,与核酶连接作用更强。,4,2020/12/1,核酶（,Ribozyme),核酶不是普通的蛋白质酶，而是一类具催化活性的核酸分子,1980,年,Cech,在嗜热四膜虫中首先发现。,目前已知具有催化功能的,RNA,结构可以分为,5,种,发卡状核酶,锤头状核酶,型内含子核酶,RNaseP,核酶,丁型肝炎病毒核酶,5,2020/12/1,天然锤头状核酶示意图,GGACA UGGCCU,CCUGUCACCGGA,3,5,U,U,U,G,U,U,G,C,U,G,A,U,G,A,GUCC,AAGCAGG,UU,A,G,底物位点,催化活性位点,6,2020/12/1,反义核苷酸药物的应用,反义核酸技术在实验室中取得了较好的效果，,90,年代以来国外一些制药公司开展了若干反义药物的临床实验。,1997,年，美国,Genta,公司研制了针对,Bcl2,基因的反义药物，用于治疗前列腺癌和其他恶性肿瘤。,美国,Hybridon,公司研制了针对巨细胞病毒（,CMV,）感染的反义药物并进行了临床实验。,7,2020/12/1,RNA,干扰药物,RNA,干扰（,RNA interference,，,RNAi,）,是一种由双链,RNA,诱导的基因表达调控和基因沉默的过程 ，其广泛存在于从植物、无脊椎动物到哺乳动物的各种生物。,RNAi,的作用原理,双链,RNA,诱导诱导,RNAi,的过程主要分为两个阶段：,启动阶段,执行阶段,8,2020/12/1,9,2020/12/1,RNAi,的作用原理,启动阶段,当细胞中由于感染等原因出现双链,RNA,分子时，细胞中一种称为,Dicer,的核酸酶就会识别这些双链,RNA,，并将其降解成,21-23bp,长的小干扰,RNA,（,siRNA,），单链,siRNA,与一些蛋白形成复合体，构成“,RNA,诱导的沉默小体”,（,RNA-induced silencing complex,，,RISC,）,执行阶段,当目标,mRNA,与,RISC,中的,siRNA,完全配对,时，,RISC,就会切割目标,RNA,，并由细胞中的核酸酶将其进一步降解，从而抑制目标基因的表达,10,2020/12/1,启动阶段原理图,启动阶段,RISC,RISC,前体,Dicer,（,21-23bp,）,siRNA,11,2020/12/1,执行阶段原理图,执行阶段,核酸酶切割,胞内其它,AAAAAAA,切割,RISC,AAAAAAA,mRNA,核酸酶切割,胞内其它,AAAAAAA,切割,RISC,AAAAAAA,mRNA,12,2020/12/1,siRNA,药物,长链的,RNA,会诱导细胞合成并分泌干扰素，干扰素又会抑制细胞的蛋白质合成，造成一定的副作用。如果直接用,21-23bp,的,小双链,RNA,即,siRNA,，则,不会诱导干扰素反应,，,却能在细胞中激活,RISC,，,发挥抑制基因表达的作用,。,siRNA,的作用,体外实验和动物模型研究证明,siRNA,药物可以成功抑制,HIV,、乙肝病毒、流感病毒、,SARS,冠状病毒、口蹄疫病毒等的感染。,siRNA,还可以治疗一些非感染性疾病,：美国正在开发一种治疗老年性黄斑变性的,siRNA,药物,13,2020/12/1,siRNA,药物优点与缺点,优点：与反义,RNA,相似，,siRNA,作为药物,具有目标基因专一,性强,与反义,RNA,相比，,siRNA,药物的,作用机制更加明确，,效果更加肯定,缺点：,siRNA,的作用需要与目标,RNA,间发生完全的配对，因,此,对于目标,RNA,的突变很敏感。,个别位点的突变会使,效果大打折扣,在用于抗病毒治疗时，病毒可能出现抗药突变株,14,2020/12/1,siRNA,的设计和制备,siRNA,的制备,实验室制法：,构建目标基因两侧分别带有噬菌体,T7,、,SP6,等启动子的表达质粒,体外转录,正义链,反义链,混合,双链,RNA,Dicer,酶加工,Dicer,酶加工,siRNA,构建目标基因两侧分别带有噬菌体,T7,、,SP6,等启动子的表达质粒,体外转录,构建目标基因两侧分别带有噬菌体,T7,、,SP6,等启动子的表达质粒,体外转录,正义链,构建目标基因两侧分别带有噬菌体,T7,、,SP6,等启动子的表达质粒,体外转录,反义链,正义链,构建目标基因两侧分别带有噬菌体,T7,、,SP6,等启动子的表达质粒,体外转录,构建目标基因两侧分别带有噬菌体,T7,、,SP6,等启动子的表达质粒,体外转录,构建目标基因两侧分别带有噬菌体,T7,、,SP6,等启动子的表达质粒,体外转录,正义链,构建目标基因两侧分别带有噬菌体,T7,、,SP6,等启动子的表达质粒,体外转录,反义链,正义链,构建目标基因两侧分别带有噬菌体,T7,、,SP6,等启动子的表达质粒,体外转录,反义链,正义链,构建目标基因两侧分别带有噬菌体,T7,、,SP6,等启动子的表达质粒,体外转录,反义链,正义链,构建目标基因两侧分别带有噬菌体,T7,、,SP6,等启动子的表达质粒,体外转录,Dicer,酶加工,siRNA,Dicer,酶加工,siRNA,Dicer,酶加工,siRNA,实验室制法：,构建目标基因两侧分别带有噬菌体,T7,、,SP6,等启动子的表达质粒,体外转录,实验室制法：,构建目标基因两侧分别带有噬菌体,T7,、,SP6,等启动子的表达质粒,体外转录,实验室制法：,构建目标基因两侧分别带有噬菌体,T7,、,SP6,等启动子的表达质粒,正义链,体外转录,实验室制法：,构建目标基因两侧分别带有噬菌体,T7,、,SP6,等启动子的表达质粒,反义链,正义链,体外转录,实验室制法：,构建目标基因两侧分别带有噬菌体,T7,、,SP6,等启动子的表达质粒,反义链,正义链,体外转录,实验室制法：,构建目标基因两侧分别带有噬菌体,T7,、,SP6,等启动子的表达质粒,反义链,正义链,体外转录,实验室制法：,构建目标基因两侧分别带有噬菌体,T7,、,SP6,等启动子的表达质粒,混合,反义链,正义链,体外转录,实验室制法：,构建目标基因两侧分别带有噬菌体,T7,、,SP6,等启动子的表达质粒,双链,RNA,混合,反义链,正义链,体外转录,实验室制法：,构建目标基因两侧分别带有噬菌体,T7,、,SP6,等启动子的表达质粒,Dicer,酶加工,双链,RNA,混合,反义链,正义链,体外转录,实验室制法：,构建目标基因两侧分别带有噬菌体,T7,、,SP6,等启动子的表达质粒,siRNA,Dicer,酶加工,双链,RNA,混合,反义链,正义链,体外转录,实验室制法：,构建目标基因两侧分别带有噬菌体,T7,、,SP6,等启动子的表达质粒,15,2020/12/1,siRNA,的设计和制备,siRNA,的设计,应选取,对于疾病发生具有至关重要作用，而对细胞的其他功能影响不大的,保守基因,作为目标基因，再根据目标基因的序列设计,siRNA,Tom Tuschl,根据实验提出了一个,设计,siRNA,的原则,：,选择转译起始密码子后,50-100,碱基,的范围，以,AA,作为正义链的第,1,，,2,个核苷酸，,GC,比为,50,左右,，同时在,正义链和反义链的,3,-,都有,TT,两个核苷酸的突变,16,2020/12/1,siRNA,的设计和制备,siRNA,的制备,siRNA,Dicer,酶加工,双链,RNA,混合,反义链,正义链,体外转录,实验室制法：,构建目标基因两侧分别带有噬菌体,T7,、,SP6,等启动子的表达质粒,siRNA,Dicer,酶加工,双链,RNA,混合,反义链,正义链,体外转录,实验室制法,：,构建目标基因两侧分别带有噬菌体,T7,、,SP6,等启动子的表达质粒,大规模的化学合成方法：,可以在合成时加入保护基团增加,siRNA,的稳定性,大规模的化学合成方法：,可以在合成时加入保护基团增加,siRNA,的稳定性,大规模的化学合成方法：,可以在合成时加入保护基团增加,siRNA,的稳定性,17,2020/12/1,核酸药物的修饰和给药,人体内存在大量的,核酸酶,，在体内应用反义,RNA,，,siRNA,等新型核酸药物治疗时，一个,关键问题就是保证它们能够抵抗核酸酶的降解并被有效地运输到靶细胞,。,RNA,的化学修饰,是一个有效的途径,修饰磷酸二酯键,修饰核酸,修饰骨架,化学修饰,修饰骨架,化学修饰,修饰核酸,修饰骨架,化学修饰,修饰磷酸二酯键,修饰核酸,修饰骨架,邓子新,Nature Chemical Biology 2007.,18,2020/12/1,核酸药物的修饰和给药,增强核酸药物有效运送到靶组织的方式：,用,脂质体等材料包埋,核酸药物静脉注射。如果在脂质体上加入,有助于膜融合的分子,如氯喹,，可以进一步提高它们进入细胞的效率,在核酸分子上,连接一段可以进入细胞的肽段,即转导肽,不同的应用目的应采用不同的给药方式：局部注射、静脉注射，有报道表明核酸药物还可以通过皮肤给药,19,2020/12/1,THANK YOU,20,2020/12/1,谢谢大家！,结 语,