重组DNA-分子克隆技术

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,重组,DNA,技术,Recombinant,DNA Techniques,主要内容,基本知识,实验流程,实验操作,相关问题,第,1,部分：基本知识,克隆与克隆化,克隆：,指同一副本或拷贝的集合,克隆化：,获取同一拷贝的过程称为克隆化。,分子克隆：,为某一研究目的，从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，继而经无性繁殖（扩增）产生的很多相同分子的集合。,DNA,克隆,DNA,克隆就是应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体,DNA,结合成一具有自我复制能力的,DNA,分子,复制子，继而通过转化或转染宿主细胞,筛选出含有目的基因转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一,DNA,分子，即,DNA,克隆又称重组,DNA,。,基因重组,(gene recombination),是指,DNA,片段胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。,基因工程,(genetic engineering,）,是指采用人工方法将不同来源的,DNA,进行重组，并将重组后的,DNA,引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程。 又称为重组,DNA,技术,(,recom-binant,DNA technology),。,相关酶类,（,1,）限制性内切酶：,识别特异序列，切割,DNA,（,2,）,DNA,连接酶：,催化,DNA,中相邻的,5,磷酸基,与,3,羟基间形成磷酸二酯键，使,DNA,切口,封合，连接,DNA,片段,（,3,）,DNA,聚合酶,：,a.,合成双链,cDNA,中第二条链。,b.,缺口平移制做探针。,c.DNA,序列分析。,d.,填补,3,末端。,（,4,）,Taq,酶：,催化,PCR,反应，聚合,DNA,（,5,）反转录酶：,a,.,合成,cDNA,。,b,.,替代,DNA,聚合酶,进行填补,（,6,）多聚核苷酸激酶：,催化,DNA 5,羟基末端,磷酸化，或标记探针,（,7,）碱性磷酸酶：,切除,DNA5,末端磷酸基,（,8,）末端转移酶：,在,3,羟基末端进行同系多,聚核苷酸加尾。,（,9,）,DNA,酶：,切割,DNA,（,10,）,RNA,酶：,切割,RNA,目的基因,有时应用重组,DNA,技术分离、获得某一感兴趣的基因或,DNA,序列，有时是为获得感兴趣基因的表达产物,蛋白质。,目的,DNA,有两种类型：,cDNA,和基因组,DNA,。,cDNA,是指在体外经反转录合成的、与,RNA,（通常指,mRNA,）互补的单链,DNA,，经聚合反应，单链,cDNA,进而合成双链,cDNA,。,基因组,DNA,是指包含一个细胞或生物体整套遗传信息的所有,DNA,序列。,载体：,是指为,“,携带,”,感兴趣的外源,DNA,实现外源,DNA,的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用,的一些,DNA,分子，,是运载外源,DNA,有效进入受体,细胞内的工具,。可分为克隆载体和表达载体。,克隆,载体,的条件：,有某种限制酶的一个切点，最好是有许多种限制酶,的切点，而且每种酶的切点只有一个；,外源,DNA,插入后不影响载体在受体细胞中进行自我,复制，载体应对受体细胞无害，以及载体能接纳尽,可能大的外源,DNA,片段；,有利于选择的标记基因，可以很方便知道外源,DNA,已经插入，以及把接受了载体的受体细胞选出；,具有促进外源,DNA,表达的调控区。,多克隆位点,ori,复制起始点,遗传标记,Amp,polylinker,基因载体,表达载体,为使插入的外源,DNA,序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。,表达载体的条件,转录的启动子和终止子,核糖体结合位点,基因拷贝数,宿主细胞的翻译效率,表达蛋白在细胞中的稳定性,载体的类型：,可充当克隆载体的,DNA,分子有质粒,DNA,、噬菌体,DNA,和病毒,DNA,等。,质粒（,plasmid,）载体,是存在于细菌染,色体外的小型环,状双链,DNA,分子。,大小约为数千碱,基对。常有,1-3,个抗药性基因，,以利于筛选。,噬菌体（,phage,）载体,（,1,）,噬菌体,DNA,改造系统,（,2,）,M13,噬菌体,DNA,改造系统,其他载体,柯斯质粒,酵母人工染色体载体,细菌人工染色体,病毒,DNA,改造的载体,第,2,部分：试验流程,（,1,）获得目的基因，选取合适载体；,（,2,）基因与载体连接，形成重组,DNA,分子；,（,3,）重组,DNA,分子转化受体细胞，并能在受体,细胞中复制和遗传；,（,4,）对转化子筛选和鉴定；,（,5,）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，,获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。,第,3,部分：实验操作,第,1,步：目的基因的获取,1,化学合成,DNA,：,如果已知某基因的核苷酸序列，或根据某,种基因产物的氨基酸序列推导出该多肽编,码基因的核苷酸序列，再利用,DNA,合成仪,通过化学合成原理合成目的基因。,2,基因组,DNA,：,采用物理方法,(,剪切或超声波,),或限制性内切酶,将染色体,DNA,切割成许多片段，继而将它们,与适当克隆载体结合，将重组,DNA,转入受体,菌中扩增，每个细菌内都携带一种重组,DNA,分子的多个拷贝。全部细菌所携带的各种染,色体,DNA,片段就涵盖了基因组全部信息，即,基因文库,。建立基因文库后，结合适当筛选,方法从众多的转化子菌株中选出含某一基因,的菌株，扩增分离得到目的基因。,3,cDNA,：,以,mRNA,为模板，,利用反转录酶合成,与,mRNA,互补的,DNA,，再复制成,双链,cDNA,片段，,与适当载体连接后,转入受体菌，扩增,为,cDNA,文库,。用,适当方法,cDNA,文,库中就可以筛选分,离到目的基因。,4,聚合酶链式反应（,PCR,）：,在有模板,DNA,、引物及,dNTP,存在时，向,DNA,合成体系中引入热稳定的,Taq,DNA,聚,合酶。反应体系经变性、退火及扩增循环,自动。反复进行感兴趣,DNA,片段的酶促合,成，使目的基因按指数增长。,变性、退火、延伸三步曲,变性：,双链,DNA,解链成为单链,DNA,退火：,部分引物与模板的单链,DNA,的特定互,补部位相配对和结合,延伸：,以目的基因为模板，合成互补的,DNA,链,每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍,30,轮循环可获得,2,30,（,1.07109),个基因片段,5,、几种重要的,PCR,衍生技术,反转录,PCR,技术,原位,PCR,技术,实时,PCR,技术,PCR,扩增结果实例,第,2,步：克隆载体的选择,1.,质粒：,存在于细菌染色体外，小型闭合环状双链,DNA,分子，可独立自主进行复制，含筛选标记，含多种限制性内切酶的单一切割位点，可插入目的基因。,2.,噬菌体：,噬菌体、,MB,载体。可通过转染方,式将其,DNA,送入细菌体内进行增殖。目的基因,与噬菌体,DNA,进行重组时，可采用插入重组方,式，也可采用置换重组方式。,3.,柯斯质粒与酵母人工染色体载体,：用于插入大,DNA,片段。,4.,病毒载体：,TMV,，,CaMV,，,PVX,等，瞬时表达常用。,病毒增殖水平较高,可使伴随的外源基因高水平表达；,病毒增殖速度快,外源基因在很短时间,(,通常在接种后,12,周内,),可达最大量的积累；,病毒基因组小,易于进行,遗传,操作,大多植物病毒可以通过机械接种感染植物,适于大规模商业操作,;,宿主范围广,一些病毒载体能,侵染,农杆菌不能或很难转化的单,子叶,、,豆科,和多年生,木本植物,扩大了,基因工程,的宿主范围,;,病毒颗粒易于纯化,可显著降低下游生产成本。所以植物病毒是外源基因的瞬时高效表达载体。,第,3,步：外源基因与载体的连接,即,DNA,的体外重组。这种,DNA,重组是靠,DNA,酶将外源,DNA,与载体共价连接的。,1,粘性末端连接,(1),同一限制酶切割位点连接,由同一限制性核酸内切酶切割的不同,DNA,片段具有完全相同的末端。那么，当这样的两个,DNA,片段一起退火时，粘性末端单链间进行碱基配对，然后在,DNA,连接酶催化作用下形成共价结合的重组,DNA,分子。,(2),不同限制酶切割位点连接,由两种不同的限制性核酸内切酶切割的,DNA,片段，具有相同类型的粘性末端，即配对末端,粘端连接,CCGG CCGG,GGCC GGCC,CGG C,C GGC,CGG C,C GGC,CCGG,GGCC,Hap,T4-DNA连接酶,Hap,2,平端连接,限制性内切酶作用产生的平端,粘端经特殊酶处理变为平端,平端连接,AGCT,TCGA,Alu,DNA连接酶,AGCT AGCT,TCGA TCGA,Alu,3,同聚物加尾连接,同聚物加连接是利用同聚物序列，如多聚,A,与,多聚,T,之间的退火作用完成连接。在末端转移,酶作用下，在,DNA,片段制造出粘性末端，而后,进行粘性末端连接。,同聚物加尾连接,5,5,5,5,AAA,AAA,TTT,TTT,TdT,酶,连接酶,4,人工接头连接,由平端加上带有新的酶切位点的寡核苷,酸，再用限制酶切产生粘性末端，进行,连接。,人工接头连接,BamHI,BamH,I,BamHI,第,4,步：重组,DNA,导入受体细胞,根据重组,DNA,时所采用的载体性质不同，导入重组,DNA,分子有转化、转染和感染等不同手段,。,1,.,感受态细胞。,经一定方法处理,(,如,CaCl2,处理,),后具备接受外界,DNA,能力的大肠杆菌。受体菌应为安全无毒菌株，且为限制酶缺陷型及重组缺陷型。,2.,转化、转染及感染。,转化：,以质粒为载体，将携带外源基因的载,体,DNA,导入受体细胞。,转染：,以噬菌体为载体，用,DNA,连接酶使噬,菌体,DNA,环化，再通过质粒转化方式导入受,体菌。,感染：,以噬菌体为载体，在体外将噬菌体,DNA,包装成病毒颗粒，使其感染受体菌。,50-100mmol/L,CaCl,2,感受态细菌,重组体,转入细菌,转化,第,5,步：重组体克隆的筛选和鉴定,1,直接选择法,直接法是针对载体携带某种或某些标志基因,和目的基因而设计的筛选方法，其特点是直,接测定基因表型。,（,1,）抗药性标志选择：,如果克隆载体携带有某,种抗药性标志基因，则只有含这种抗药基因,的转化子细菌才能在含该抗菌药物的培养板,上幸存并形成菌落。,（,2,）标志补救：,若克隆的基因能够在宿主菌,表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷,互补，那么就可以利用营养突变菌株进,行筛选，这就是标志补救筛选。,2.,酶切和电泳,挑取单菌落，于液体培养基中培养；,收集菌体，提取纯化质粒；,对质粒进行限制性内切酶酶切；,琼脂糖凝胶电泳检测；,根据酶切产物的大小，鉴定阳性克隆。,3. PCR,和电泳,挑取平板上生长的单菌落直接进行,PCR,；,单菌落于液体培养基中培养的菌液,PCR,；,对提取的质粒进行,PCR,；,凝胶,电泳检测,加样孔,DNA Marker,空质粒,重,组质粒,重组质粒,酶切,重组质粒的,PCR,扩增片段,酶切鉴定结果实例图,4.,分子杂交法,利用,32,P,标记的探针与转移至硝酸纤维素膜上的,转化子,DNA,或克隆的,DNA,片段进行分子杂交，直,接选择并鉴定目的基因。,原位杂交,Southern,印迹,5.,免疫学方法,利用特异抗体与目的基因表达产物相互作,用进行筛选。包括：免疫化学方法、酶免,检测法,放射性抗体检测法,滤,膜（固定抗体）,+,第,6,步：克隆基因的表达,1.,表达载体的选择和构建,2.,受体细胞的建立和转化,3.,目的基因的表达及检测,4.,表达产物的分离和纯化,5.,表达产物的应用,1.,表达载体的选择和构建,（,1,）表达载体的选择,原核表达体系,大肠杆菌是当前采用最多的原,核表达体系，运用大肠杆菌表达载体符合下,述标准：,含大肠杆菌适宜的选择标志,具有能调控转录、产生大量,mRNA,的强启动子,含适当的翻译控制序列和翻译起始点等,含有合理设计的多接头克隆位点，以确保目的基因,按一定方向与载体正确衔接表达产物的分离、纯化。,大肠杆菌表达体系中尚有一些不足之处：,由于缺乏转录后加工机制，只能表达克隆的,cDNA,，,不宜表达真核基因组,DNA,由于缺乏适当的翻译后加工机制，表达的真核蛋白,质不能形成适当的折叠或进行糖基化修饰,表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体，欲使其具,有活性尚需进行复杂的复性处理,很难表达大量的可溶性蛋白。,2,真核表达体系,与原核表达体系比较，真核表达体系如酵母、昆虫、哺乳类动物细胞表达体系显示了较大优势性。尤其是哺乳类动物细胞，不仅可表达真核的,cDNA,，而且还可表达真核基因组,DNA,；将表达载体导入真核细胞的过程称转染，常用于细胞转染的方法有：磷酸钙转染、,DEAE,葡聚糖介导转染、电穿孔法、脂质体转染及显微注射。,3,、转基因动植物,将目的基因构建在动植物表达载体上，然后转化到动植物体内，在适宜启动子的作用下，目的基因在体内获得高效表达。通常用的转基因植物的操作有农杆菌介导法、花粉管通道法和基因枪方法。,表达载体的构建,外源基因在受体细胞中的表达,重组子,目的基因的,mRNA,表达蛋白质,大肠杆菌（,E.coli,）,受体细胞,目的基因表达产物的检测,蛋白质的,PAGE,对照 样品,Marker,基因表达检测实例图,目的蛋白的分离纯化,分子筛,亲和柱,离子交换,抗原抗体,目的蛋白,基因载体,目的基因,质粒 噬菌体 病毒,PCR,cDNA,人工合成 基因文库,限制性内切酶,有,切口的载体,有,切口的目的基因,DNA,连接酶,重组体,转化 转染 体外包装,带重组体的,宿主细胞,表,型,筛选 电泳法 核酸杂交 免疫学方法,目的基因的表达,相关问题,一、引物的设计,1,、引物设计原则,（,1,）,引物的长度一般为,15-30,bp,，常用的是,18-27,bp,，但不应大于,38,，因为过长会导致其延伸温度大于,74,，不适于,Taq,DNA,聚合酶进行反应。,（,2,）,引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是,3,端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物,3,端出现,3,个以上的连续碱基，如,GGG,或,CCC,，也会使错误引发机率增加。,（,3,）,引物,3,端的末位碱基对,Taq,酶的,DNA,合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为,A,的错配效率明显高于其他,3,个碱基，因此应当避免在引物的,3,端使用碱基,A,。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致,PCR,反应失败。,5,端序列对,PCR,影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。,（,4,）,引物序列的,GC,含量一般为,40-60%,，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的,GC,含量不能相差太大。,（,5,）,引物所对应模板位置序列的,Tm,值在,72,左右可使复性条件最佳。,Tm,值的计算有多种方法，如按公式,Tm,4(G+C),2(A+T),，在,Oligo,软件中使用的是最邻近法,(the nearest neighbor method),。,（,6,）,G,值是指,DNA,双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用,3,端,G,值较低（绝对值不超过,9,），而,5,端和中间,G,值相对较高的引物。引物的,3,端的,G,值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发,DNA,聚合反应。,（,7,）,引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过,4.5kcal/mol,）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使,PCR,反应不能正常进行。,（,8,）,对引物的修饰一般是在,5,端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入,PCR,产物的载体的相应序列而确定。,2,、引物设计和评价软件,Premier Primer 5,Oligo,6,在线软件,Oligonucleotide,Properties Calculator,3,、酶切位点的引入,（,1,）载体序列和目的基因序列的分析。选择表达载体多克隆位点处具有的而目的序列内部没有的酶切位点，引入引物的,5,末端。,（,2,）载体中引入序列后读码框的分析，避免出现移码,（,3,）保护碱基的选择,（,4,）进行双酶切的两个酶的反应条件分析。包括酶切温度，缓冲液，酶切效率等。,酶切位点分析常用软件,Bioedit,、,Bioxm,等,二、融合基因的构建,将两个不同的基因融合在一起，通过利用其中一个基因表达产物的功能，以更方便的研究另一个基因产物。,如,GST,目的基因、,His,目的基因、荧光蛋白目的基因等。,为保证各个基因产物的独立性和生物学功能，通常在两个基因中间插入一柔性链，,柔性链选择为,G-S,即,GGATCC,的碱基序列或者为,(G,4,S),3,即碱基序列,GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGC,G,为分子量最小的氨基酸，没有手性碳，侧链最短，空间位阻最小，能增加柔韧性；而丝氨酸是亲水性最强的氨基酸，能增加亲水性，以保持两种蛋白的独立。这样通过插入一柔性,Linker,保持了两种蛋白各自的构象和功能。,三、载体的改造,1,、在载体中引入酶切位点,在现有载体不能满足实验需求的情况下，即在分析目的基因后，确定载体上,mcs,处的酶切位点不能使用的情况下，可考虑在载体上引入其他的酶切位点。,首先要分析载体的全序列，确保在载体的其他位点不具有该酶切位点。,引入酶切位点后，要确保目的基因插入后不会发生移码,2,、特定用途载体的构建 在已有载体的基础上，通过插入一些特定序列，来构建满足实验需求的载体。,如在植物表达载体上引入抗性基因、荧光蛋白等，可用以抗性筛选和表达检测,在载体上引入强启动子或增强子，使目的基因在特定组织中能够大量表达,在普通载体上引入内含子和,mcs,，构建为专门用于,RNAi,的载体,