1.现代造血理论

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一篇 造血细胞及其检验 第一章 现代造血理论,1,造血,（hematopoiesis）是指血细胞的生成过程。,造血干细胞,在造血微环境中增殖、分化为各类血细胞。,造血系统,通过造血器官、造血干细胞、造血调控因子等组成的复杂网络来维持血液细胞的动态平衡。,2,第一节 造血器官和造血微环境,一、造血器官,人体的造血器官是生成血液的器官,起源于,中胚叶,，主要包括,骨髓,、,胸腺,、,淋巴结,、,肝脏,和,脾,等,其造血过程分为,胚胎期造血,和,出生后造血,3,（一）胚胎期造血器官,人类的血液细胞首先在卵黄囊中形成，肝、脾、胸腺和骨髓均参与造血,根据发育过程中造血中心的转移，胚胎期造血又分为,三,个时期：,卵黄囊造血期,、,肝造血期,、,骨髓造血期,4,1,卵黄囊造血期,（中胚叶造血期）,始于胚胎,3周,左右，卵黄囊壁上的,中胚层细胞,开始分化聚集成团，称为,血岛,（blood island）。血岛是人类最初的造血中心。,血岛,外周的细胞逐渐变长，分化为,血管内皮细胞,5,血岛,中央的细胞形成,多能造血干细胞,，继尔分化成,幼稚红细胞,，以后大量的多能造血干细胞迁移至肝、脾、骨髓和淋巴组织继续增殖、分化为,干细胞,。,胚胎 2个月后，卵黄囊逐渐退化、萎缩,被肝、脾取代其造血功能。,6,2,肝造血期,始于胚胎,第6周,，是卵黄囊血岛的,造血干细胞,移植到肝脏的结果，以造,红细胞,为主，后期可生成,粒细胞,和,巨核细胞,。,肝脏是胚胎,25个月,的造血中心，持续至第7个月时，逐渐被骨髓造血替代。,此外脾、胸腺、淋巴结等也参与造血。,7,胎肝,造血的规律：,造血细胞,分布在肝窦、肝细胞索之间。,胎肝造血以,幼稚红细胞,为主，巨核细胞常与红系细胞在一起。,胎肝造血细胞的密度随妊娠日期的不同而变化。证明肝造血在第,15周,以前为上升期，,1530周,为旺盛期，,24周,以后为减退时期，至出生前停止。,故肝造血为,第二代造血,。,8,脾造血,始于胚胎第3个月，主要生成,红细胞、粒细胞,，第5个月时产生,淋巴细胞,、,单核细胞,，而红细胞和粒细胞的产生逐渐减少。至出生时，脾已成为产生淋巴细胞的器官。,胸腺,在胚胎期主要产生,淋巴细胞,和少量红细胞、粒细胞，胚胎后期成为诱导和分化T淋巴细胞的器官。,淋巴结,在胚胎早期可产生红细胞，但时间很短，在胚胎4个月以后，成为,终生制造淋巴细胞,和,浆细胞,的器官,。,9,3,骨髓造血期,自胚胎第,14周,骨髓开始造血，,5个月,以后成为胚胎期的造血中心。,骨髓中的造血干细胞来源于,肝,、,脾,的,种植,，可维持终生。,胚胎期的骨髓主要生成,红细胞,、,粒细胞,和,巨核细胞,，也生成淋巴细胞和单核细胞。,10,胚胎期造血的三个时期是不能截然分开，而是此消彼长，互为交错。,11,（二）出生后造血,出生后造血主要靠,骨髓,。,在正常情况下,骨髓,是,唯一,能产生,红细胞,、,粒细胞,和,血小板,的场所，也生成淋巴细胞和单核细胞。,脾,和,淋巴结,为终生制造,淋巴细胞,的器官。,12,1,骨髓,骨髓,是位于,骨髓腔,内的海绵样胶状组织，有,红骨髓,和,黄骨髓,之分。,婴幼儿的骨髓几乎都参与造血，即全为红骨髓。,大约从5岁开始，长骨的髓腔内出现脂肪细胞，随年龄增长，长骨远端的,红骨髓,逐渐被,脂肪组织,代替转化为,黄骨髓,。,13,到18岁以后，红骨髓只限于颅骨、脊椎骨、肋骨、胸骨、骼骨以及长骨的近心端。,因此，在作骨髓穿刺或活检时，,成人,可选择的部位是,骼骨,、,棘突,、,胸骨,等处，,胫骨粗隆,则只适用于,2岁,以下的幼儿。,成人的红骨髓和黄骨髓约各占,50%,，但黄骨髓仍有造血潜能，当机体需要时又,转变,为红骨髓而参与造血。,14,2.,淋巴器官,分为,中枢淋巴器官,和,周围淋巴器官,。,中枢淋巴器官,主要包括,胸腺,和,骨髓,，主导淋巴细胞的产生、增殖、分化和成熟。,周围淋巴器官,主要包括,淋巴结,、,脾,、,肠粘膜相关淋巴组织,等，是淋巴细胞聚集和免疫应答发生的场所。,15,(1),胸腺（thymus）,来自骨髓的,淋巴干细胞,经增殖和在,胸腺素,的作用下，诱导分化为,免疫活性细胞,，进,入,胸腺髓质,，然后释放,入,血并迁移到外周淋巴器官的胸腺依赖区成为胸腺依赖淋巴细胞即,T细胞,。青春期后，胸腺逐渐退化，被脂肪组织取代。,16,(2),淋巴结（lymph node）,淋巴结的外周部分为皮质，,B细胞,在淋巴结皮质区滤泡中央增殖、发育；,皮质深层和滤泡间隙为副皮质区，富含由胸腺迁移而来的T细胞，又称,胸腺依赖区,；,淋巴结中央部分为髓质，髓质区的B细胞、浆细胞及巨噬细胞集结构成,髓索,17,(3)脾,脾切面大部分呈暗红色，称,红髓,，其中散布着许多灰白色小结节，为,白髓,。,白髓是淋巴细胞的聚集处，在,中央小动脉周围,主要是T细胞，是脾的胸腺依区；,白髓中的脾小结位于脾动脉,周围淋巴鞘,内一侧，内有生发中心，主要由B细胞构成。,脾具有,造血,、,储血,及,免疫,等多种功能，是T、B细胞分化成熟的,主要,场所之一。,18,3.,髓外造血,正常情况下，胎儿出生2个月以后，骨髓以外的组织如肝、脾淋巴结等不再制造红细胞、粒细胞和血小板。,但在某些病理情况下，如骨髓纤维化、骨髓增生性疾病及某些贫血，这些组织又恢复造血功能（常可导致相应器官肿大），称为,髓外造血,。,19,髓外造血,是机体对血细胞的需求特别增高或对骨髓造血障碍的一种补偿，,尤其常见于,儿童,。,这种代偿作用有限且不完善。,髓外造血部位除,肝、脾、淋巴结,外，也可以累及,胸腺、肾、肾上腺、腹腔后脂肪及胃肠道,。,20,二、造血微环境,造血微环境,（hematopoietic microenvironment）是指造血细胞,生长,、,发育,的内环境。,由,微血管系统,、,末梢神经,、,基质,、,基质细胞,及基质细胞分泌的,细胞因子,等组成，不仅是造血细胞的支架，还可通过细胞之间的相互作用和释放的细胞因子影响造血活动。,21,（一）骨髓微血管系统,骨髓微血管系统是造血微环境的重要组成部分,其功能在于向造血组织输送营养物质，排出代谢废物，从而有利于造血细胞的更新。,毛细血管注人管腔膨大的,静脉窦,，再彼此沟通汇集成,集合窦,，最后进人,中央静脉,。,静脉窦,与,集合窦,（统称为,骨髓血窦,）是骨髓血管系统的核心结构。,22,血窦（Sinusoid）,是动脉毛细血管分成的不规则窦状腔隙。,血窦内是成熟的血细胞，血窦之间则充以骨髓实质(造血索)，主要是活跃的,造血实质细胞,。,血窦壁是由连续的内皮细胞、颗粒状基底膜和外皮细胞所组成，其窦壁的薄厚是可变的,绝大多数的窦壁仅有一层,内皮细胞,组成，平时无孔，当血细胞穿过内皮细胞时形成临时通道。,23,不同造血功能的骨髓其微血管的结构不同,造血功能旺盛时，骨髓血窦很丰富，窦壁孔隙增多；,造血功能低下的骨髓，骨髓血窦减少，无造血功能的黄骨髓中，微血管呈毛细管状。,骨髓的微血管系统通过调节物质与能量的交换、血细胞的释放、组织内的酸碱度、氧和二氧化碳分压等影响造血细胞的增殖和分化。,24,（二）骨髓神经,骨髓的神经来源于,脊神经,，其神经供应十分广泛，骨髓的全部动脉都伴有神经束，其分支缠绕于动脉壁呈网状，神经纤维终止于动脉壁的平滑肌纤维。,骨髓小动脉上的交感神经纤维受延髓血管运动中枢的控制，但绝大多数的骨髓微血管床主要受血管活性物质的调节。,25,骨髓神经的,作用,：,（1）通过调节血管的舒缩，改变血窦的大小及血流速度的快慢等影响造血,（2）神经分泌的体液因子可直接作用于造血细胞,（3）基质细胞分泌的细胞因子调节造血功能,26,（三）基质细胞及其分泌的调控因子,骨髓基质细胞,包括成,纤维细胞,、,内皮细胞,、,脂肪细胞,和,巨噬细胞,等，,它们通过与造血干细胞的密切接触起到,支持,和,营养,造血细胞的作用。,各种基质细胞都有,分泌细胞因子,的功能，其分泌的生物大分子物质都与造血细胞的,粘附,有关，可粘附固定造血细胞。,27,基质细胞还分泌多种细胞因子，,如白细胞介素、FLT-3配基、干细胞因子、粒一巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子等，,这些细胞因子不仅直接作用于造血细胞，而且作用于基质细胞，改变基质细胞的增殖和分泌状况，诱导其它细胞因子的生成。,对造血细胞的增殖、分化和发育成熟起重要的调控作用。,28,Go on.,29,第二节 造血细胞的生长发育和造血调控,一、造血细胞的生长发育,胚胎造血组织的发育是血细胞发生、发育研究的基础，也是血液学研究必不可少前提。,造血细胞的生长发育是一个连续不断的复杂过程，造血器官内的各种造血细胞在造血微环境中通过细胞与细胞之间的相互作用，在各种细胞因子的诱导下，按一定的规律发育成为各种成熟的血细胞，然后释放入血循环中。,30,（一）造血细胞生长发育的概念,造血细胞的生长发育包括,增殖,、,分化,、,成熟,和,释放,四个方面。,造血细胞的,增殖,是指血细胞通过分裂而使其数量增加的过程。,有丝分裂是造血细胞的主要增殖方式。,31,母细胞有丝分裂后形成的子细胞同时都倾向分化成熟。,子细胞还可进一步增殖，每增殖一次就越倾向于进一步分化。,一般来讲，一个原始细胞到成熟细胞可经过,45,次分裂，如1个原始红细胞可产生32个或64个成熟红细胞。,而巨核细胞的增殖（连续双倍增殖DNA）与其他系统血细胞的增殖方式不同，每增殖一次，核增大一倍，但,胞质并不分裂,，属多倍体细胞，形态上也表现为从原始到成熟胞体,逐渐变大,。,32,造血细胞的分化（differentiation）,是指细胞发育过程中,失去,某些潜能又,获得,新的功能的过程，即由多潜能转变为单潜能的过程。,分裂后的细胞在,形态,和,功能,上产生了新的特征，分化过程是,不可逆,的。,33,造血细胞的成熟（maturation）,是细胞从造血干细胞定向分化后，从,原始,经,幼稚,到,成熟,的细胞发育过程，,血细胞越成熟其形态越,易,辨认，功能也日趋完善。,34,成熟的血细胞在骨髓内通过,“髓血屏障”,释放入血循环中，各种调节因素控制着血细胞的增殖、分化、成熟和释放，从而维持血细胞,数量,和,质量,的稳定。,35,（二）造血细胞生长发育的过程,根据造血细胞的功能和形态特征，,造血细胞的生长发育过程可为：,造血干细胞,、,造血祖细胞,、,原始及幼稚细胞,三个阶段。,原始及幼稚细胞阶段的细胞是在骨髓涂片中从形态学上可以辨认各系各阶段的血细胞,。,36,造血干细胞阶段,造血组细胞阶段,原始及幼稚细胞阶段,成熟细胞,37,二、造血干祖细胞,干细胞（stem cell）,是具有自我复制和多向分化能力的细胞。,早期胚胎中的原始生殖细胞即,胚胎干细胞,，具有广泛的发育和分化潜能，称为,全能干细胞,（totipotent hematopoietic stem cell,T HSC,）。,胚胎干细胞,可分化为各类组织干细胞，造血组织中存在,造血干细胞,、,血管干细胞,和,间质干细胞,。,38,（一）造血干细胞,造血干细胞,（hematopoietic stem cell,HSC,）的概念于20世纪初就有人提出，但当时的含义不甚明确，研究内容模糊不清，直至发现了,脾集落形成单位,之后，造血干细胞在六七十年代引起了人们的关注。,随着新技术的发展，造血干细胞在临床应用等方面潜在的巨大价值被逐步发现，目前已成为生命科学研究领域的热门课题。,39,造血干细胞,又称,多能干细胞,，由,中胚层细胞,分化而来，是各种血细胞的,始祖,，具有高度自我更新、多向分化和增殖能力，并且在造血组织中含量极少，其形态酷似小淋巴样细胞而难以辨认。,在体内造血干细胞多数处于,G,0,期。,造血干细胞,可增殖分化为,髓系干细胞,和,淋巴干细胞,。,40,1.,造血干细胞的基本特征,(1),自我更新,：即细胞通过有丝分裂产生的两个子代细胞与亲代细胞具有相同的特征。造血干细胞的自我更新是维持其数量平衡的基础，亦称,自我维持,。高度的自我更新能力是造血干细胞基本的生物学特征之一。,41,(2）,多向分化,：即造血干细胞具备分化为各系造血祖细胞的潜能，是造血干细胞的另一个基本的生物学特征，造血干细胞的分化受到多种正负调控因子的调节，在特定的条件下可以分化成红细胞、粒细胞（中性、嗜酸性、嗜碱性）、单核细胞、血小板、组织嗜碱细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞及自然杀伤细胞等的祖细胞。,分化是,不可逆,的，造血干细胞一旦定向分化为某种祖细胞，就不可能再变成其他的祖细胞。,42,2,造血干细胞检测,单个细胞在生物体内有能力长期重建造血是判断该细胞为造血干细胞的“金标准”。,由于造血干细胞的数量极少，且形态上不能区别，也没有造血干细胞的表面标志，目前还没有建立体外直接测定造血干细胞的方法。,43,（1）,脾集落测试法,1961年Till等首先采用体内试验小鼠脾集落形成间接证明了造血干细胞的存在：,将受体小鼠以致死剂量射线照射后，破坏全部造血细胞，动物因造血功能衰竭而死亡；如输以供体骨髓或血液，小鼠能存活，并在受体小鼠脾中形成红系、粒系、巨核系细胞组成的结节即脾集落，经证实所有这些细胞都是由单个细胞增殖分化而来，即脾集落形成单位（CFU-S）；,如将脾结节细胞静脉注射给受体小鼠，该小鼠也能存活。证实了骨髓或血液中存在血液细胞的祖先细胞。,44,20世纪80年代出现了一系列体外检测造血干细胞的试验方法，但只能部分证实造血干细胞,自我更新,和,多向分化,两个特征，,如混合集落(CFU-Mix )培养，,高增殖潜能细胞(HPP-CFC）培养，,原始细胞集落形成细胞（CFU-Blast )培养，长期培养起始细胞（LTC-IC )检测等。,45,（2）,单克隆抗体法,利用FACS自动细胞分选系统分选出单个CD34,+,细胞亚群细胞-CD34,+,CD38,+,及CD34,+,CD38,，在无血清体系中加入各种细胞因子（如SCF、IL-3、IL-6、GM-CSF及Epo）刺激，结果表明，CD34,+,CD38,单个细胞可形成原代集落，并可向红系、粒系、巨噬系、巨核系等 细胞分化。,证明了CD34,+,CD38,细胞的性能接近于造血干细胞，同时也证明了造血干细胞具有多向分化的能力，还有实验表明，造血干细胞具有向淋巴细胞分化的能力。,46,目前造血干细胞的表面标记尚未确定。,一般认为CD34阳性细胞具有长期重建造血的能力，推测部分造血干细胞CD34阳性；,CD34阳性CD38阴性细胞比CD34阳性细胞具有更强的长期造血能力；,AC 133阳性细胞也被认为是早期造血细胞的标志。,明确造血干细胞的表面标记不但具有重要理论价值，也有助于分离纯化高质量的造血干细胞供临床应用。,47,（二）造血祖细胞,造血干细胞,进一步分化为各种,造血祖细胞,（hematopoietic progenitor cell）。,造血祖细胞,是一类由造血干细胞分化而来，但失去自我更新能力的过渡性、增殖性的细胞群，过去称为,定向干细胞,。,48,造血祖细胞有年龄结构，根据其分化能力，可分为,多向祖细胞,和,单向祖细胞,，,多向祖细胞可进一步分化 为单向祖细胞。,通过体外造血细胞半固体培养证实了造血祖细胞的存在。,49,产生红细胞的祖细胞称为：,红细胞爆式集落形成单位,（,BFU-E),（早期）,和,红细胞集落形成单位,(CFU-E),BFU-E,50,产生粒细胞和单核细胞的祖细胞称为：,粒-单核细胞集落形成单位,（CFU-GM）,CFU-GM,51,产生巨核细胞的祖细胞称：,巨核细胞集落形成单位,（CFU-Meg）,CFU-Meg,52,另外，产生嗜酸性粒细胞的祖细胞称为,嗜酸性粒细胞集落形成单位,（CFU-Eo）；,产生嗜碱性粒细胞的祖细胞称为,嗜碱性粒细胞集落形成单位,（CFU-Bas）；,产生T淋巴细胞的祖细胞称为T,淋巴细胞集落形成单位,（CFU-TL）；,产生B淋巴细胞的祖细胞称为,B淋巴细胞集落形成单位,(CFU-BL) 。,这些祖细胞失去了自我更新的能力，但有较强的增殖和定向分化能力。,造血祖细胞表面的主要免疫标记已明确，因此，根据这一特性，可采用流式细胞术或其他免疫学技术来分析造血祖细胞，甚至可以使之分离纯化。,53,（三）造血干祖细胞的临床应用,造血干祖细胞的临床应用主要涉及到造血干祖细胞移植。,目前造血干祖细胞主要来源于骨髓、外周血和脐血，不同来源的造血干祖细胞的移植在临床上各有其优缺点。,54,造血干祖细胞移植主要应用于：,1.血液系统恶性肿瘤，如急、慢性白血病等；,2.血液系统非恶性肿瘤性疾病，如再生障碍性贫血、异常血红蛋白病、Fanconi贫血、难治性贫血等；,3.实体肿瘤化疗后造血重建，如乳腺癌、卵巢癌、神经母细胞瘤等；,4.其他，如重症联合免疫缺陷症、自身免疫性疾病、基因治疗等。,55,三、造血调控,造血细胞的增殖、分化受控于不同的调控系统，以保持各种血细胞数量和质量的相对稳定。,造血调控作用于血细胞发育的每一阶段，体内许多因素参与了这一过程，其中细胞因子的调控占重要地位。,细胞因子（cytokines）,是一组基因编码的低分子量蛋白质细胞外信号分子，有的是糖蛋白，有的则不含糖基，在机体内含量极低，半衰期短，主要功能是在细胞间传递信息，从而影响造血活动。,56,（一）,集落刺激因子类,( colony-stimulating factors, CSFs ),CSFs在半固体细胞培养中能促进造血细胞集落形成。主要有以下几种：,1.红细胞生成素（erythropoietin，EPO）,主要的生物学功能是刺激红系祖细胞的增殖和分化，以提高红细胞数量。,2.粒细胞集落刺激因子(G-CSF),除促进粒系祖细胞形成集落外，G-CSF可诱导某些白血病细胞株分化成熟，激活中性粒细胞的吞噬功能，诱导早期造血干祖细胞从场期进人细胞周期。,57,3.粒一巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),GM-CSF除了促进中性粒细胞、单核细胞祖细胞增殖、分化成熟外，对成熟细胞也产生作用,4.巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）,促进单核系祖细胞的增殖和分化，激活巨噬细胞的吞噬和分泌功能。,5.多系集落刺激因子（multi-CSF）,促进造血干祖细胞的增殖、分化，促进多系集落生长。,6.血小板生成素（thrombopoietin, TPO）,促进造血干祖细胞的增殖、分化；促进巨核细胞集落形成。,58,（二）,白细胞介素,（interleukin, IL),白细胞介素主要是白细胞产生的信号分子，不仅在免疫系统中传递信息，同时也参与造血系统的造血调控，其主要生物学功能见（临床免疫学检验。,59,（三）,其他细胞因子,1.干细胞因子（stem cell factor, SCF） 又称肥大细胞生长因子,促进肥大细胞生长；协同促进造血干祖细胞增殖、分化。,2FLT-3配基(FLT-3 ligand, FL),诱导处于静止期的造血干祖细胞进人细胞周期，促进其扩增。,60,目前发现对造血有调节作用的细胞因子有近50种，它们对造血的调控有正向和负向调节，一种细胞因子对一类细胞可能以正向调节为主，而对另一类细胞则可能是反向抑制，并且不同的浓度作用效果也不一样。,大多数人类的细胞因子可以通过基因工程制备，有的已成功用于临床，如EPO较早地用来治疗各种贫血，尤其是与肾功能衰竭、化疗、肿瘤骨髓浸润有关的贫血，取得了显著疗效；G-CSF应用于治疗化疗引起的中性粒细胞减少症，骨髓移植和外周血造血干祖细胞的动员等。,61,第三节 造血干祖细胞体外培养技术,体内造血干祖细胞在一个极复杂的造血微环境中增殖、分化生成血液细胞。,体外造血祖细胞培养就是在体外模拟体内的生理环境，将从机体中分离出的造血祖细胞进行培养，使之生存、增殖分化。,62,造血祖细胞培养主要应用于：,1）检测造血祖细胞在骨髓、外周血和脐血中的数量,2）研究体外造血祖细胞类型、特性及生理意义,3）利用人工培养条件易于改变并能严格控制的特点，研究造血调节；,4）用于造血系统疾病发生机制，诊断、预后判断、疗效观察及治疗药物的选择等方面的研究。,63,一、造血干祖细胞体外培养的基本条件,（一）实验室条件,（二）培养的支持物,（三）营养液,（四）细胞因子,（五）血清,64,二、造血干祖细胞体外培养,各种造血祖细胞的培养条件、体系组成虽有差异，但培养过程大致相同。,造血祖细胞的培养步骤如下：,（1）分离培养细胞，并制成单个核细胞悬液。,（2）配制培养体系：按比例将培养液、细胞、血清、刺激因子加入培养体系瓶内，混匀。,（3）将配制的培养体系在37水浴，保温10min,。,65,（4）培养体系保温的同时，将琼脂等支持物煮沸融化（甲基纤维素不需加热）。,（5）待支持物降至40左右，加入培养体系并混匀。,（6）将混匀后的培养体系加入培养皿或培养板孔内，一般平行做3份。,（7）待培养物冷却凝固后，于5%CO,2,、饱和湿度及37温箱内孵育。CFU-GM需710天，CFU-E需7天，BFU-E需14天。,（8）观察结果。包括记数集落数，对部分难以确定细胞性质的集落应固定、染色后分析。,66,（一）粒一单核细胞系祖细胞（CFU-GM）培养,【原理】受检者血液或骨髓经过分离获得的单个核细胞在适当的细胞因子(GM-CSF)作用下，在体外半固体琼脂上形成由不同成熟阶段的粒细胞和单核细胞组成的细胞集落。每个集落可视为由一个粒一单核细胞系祖细胞增殖、分化而来。集落数的多少可以反映造血细胞中粒一单核细胞系祖细胞的水平。,67,（二）红系祖细胞（BFU-E,CFU-E）培养,【原理】在培养体系中加人适量的EPO，使骨髓中的造血细胞在半固体培养基上形成由红细胞组成的集落（BFU-E和CFU-E）。每个集落可视为一个红系祖细胞增殖分化而来，集落的多少可反映造血细胞中红系祖细胞的量。,68,Thank,y,ou,！,69,