121 食品中菌落总数大肠菌群数测定

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,项目12.1 食品的微生物学检验 菌落总数、大肠菌群测定,食品微生物学检验的指标,菌落总数,大肠菌群,致病菌,霉菌及其毒素,其它指标：寄生虫,常见食品微生物检验样品的采集与处理,一、我国食品微生物检验样品的取样方案,1、检验前的准备工作,仪器、药品、仪器用具灭菌、环境灭菌,2、,食品检验样品采集的原则,-,代表性,：随机抽样，避免主观性和以偏概全,-,无菌操作,：防止外来污染,-,保存和运输,：冷藏，微生物不发生变化,-,标签、记录,：过程可追溯,3、需要遵循的取样方法,（了解）,二、常见食品微生物样品的采集与处理,1、肉与肉制品样品,- 健康的禽畜肉、血液及脏器组织，一般无菌,- 微生物来源于,加工过程中的污染,2、乳与乳制品,- 成批产品按千分之一取样,3、蛋与蛋制品,- 75%酒精消毒蛋壳,- 沙门菌,4、水产品样品,- 一般取完整的个体,- 检验新鲜度,：检验肌肉内微生物含量,-,检验是否有致病菌,：取鳃、肠,5、清凉饮料样品,- 一般取完整包装,6、调味品样品,- 食醋：用灭菌碳酸钠调整pH为中性,7、冷食菜、凉菜、豆制品,- 取接触容器边缘、底部及上面不同部位的样品,8、糖果、糕点、果脯样品,- 取25克加入灭菌生理盐水225mL，1：10,9、酒类样品,-,一般不进行微生物学检验，因酒精可抑制细菌,- 一般只检验低度酒,10、粮食样品,- 粮食在生长过程中容易受到霉菌侵入,- 原粮需用75%酒精浸泡，以去除表面的蜡质,- 分离粮粒内部的霉菌，需要先用无菌水洗净表面的微生物,国际上常见的取样方案,一、国际食品微生物规范委员会取样方案,1、采样原则,-,各类微生物对人的危害程度不同,-,食品经不同条件处理后，危害度变化情况,：降低、未变、增加,2、采样方法,-,三种危害度：,1）老人和婴幼儿,2）可立即食用的食品，在食用前危害基本不变,3）食用前经过加热处理,ICMSF取样方案：分为二级法和三级法,解释四个代号：,n：系指一批产品采样个数。c：系指该批产品的检样菌数中，超过限量的检样数，即结果超过合格菌数限量的最大允许数。m：系指合格菌数限量，将可接受与不可接受的数量区别开。M：系指附加条件，判定为合格的菌数限量，表示边缘的可接受数与边缘的不可接受数之间的界限。,它是从统计学原理来考虑，对一批产品，检查多少检样，才能够有代表性，才能客观地反映出该产品的质量而设定的,（1）二级抽样方案,举例：,以生食海产品鱼为例，n=5，c=0，m=10,2,，n=5即抽样5个，c=0即意味着在该批检样中，未见到有超过m值的检样，此批货物为合格品。,只设合格判定标准m值，超过m值的，则为不合格品。检查在检样是否有超过m值的，来判定该批是否合格。,（2）三级抽样方案,例如：冷冻生虾的细菌数标准n=5，c=3，m=10,1,，M=10,2,，其意义是从一批产品中，取5个检样，经检样结果，允许3个检样的菌数是在m和值之间，如果有3个以上检样的菌数是在m和M值之间或一个检样菌数超过M值者，则判定该批产品为不合格品。,设有微生物标准m及M值两个限量如同二级法，超过m值的检样，即算为不合格品。其中以m值到M值的范围内的检样数，作为c值，如果在此范围内，即为附加条件合格，超过M值者，则为不合格。,二、美国FDA取样方案,- 与ICMSF基本一致,15个100克样品,各取25克,混合成一堆,取25克,菌落形成单位CFU (colony forming unit),菌落总数,：指样品在一定条件下培养后，,1g,或,1ml,检样总所含,细菌,菌落总数。,每个活菌,只能形成,一个肉眼可见菌落，是活的细胞总数,大肠菌群的检验,任务12-1,12.1 大肠菌群测定的卫生学意义,定义：,一群在,37,条件下培养24小时能,发酵乳糖,、,产酸,、,产气,、,需氧和兼性厌氧,、,革兰氏阴性,、,无芽孢杆菌,包括：埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等细菌,作为,粪便污染指标,，有广泛的卫生学意义,广泛用做,水源,的卫生指标和,食品加工卫生状况,的通用指标,肠杆菌科中与医学有关的常见菌族和菌属,埃希菌族 埃希菌属 大肠杆菌,志贺菌属 痢疾志贺菌,爱德华菌族 爱德华菌属 迟钝爱德华菌,沙门菌族 沙门菌属 伤寒沙门菌,枸橼酸菌属 佛劳第枸橼酸菌,克雷伯菌族 克雷伯菌属 肺炎克氏菌,肠杆菌属 产气肠杆菌,哈夫尼亚菌属 蜂窝哈夫尼亚菌,沙雷菌属 粘质沙雷菌,变形杆菌族 变形杆菌属 普通变形杆菌,摩根菌属 摩氏摩根菌属,普罗威登斯菌属 雷氏普罗威登斯菌,耶尔森菌族 耶尔森菌属 鼠疫耶尔菌,欧文菌族本 欧文菌属 草原居民欧文菌,菌族 菌属（菌种数） 代表种,大肠杆菌,(埃希氏菌属,Escherichine,),是人类和动物肠道中的正常菌群,出生后数小时就进入肠道，并终生伴随,以大肠埃希氏菌（,E.coli,）最为重要,大肠杆菌O157,侵袭性大肠杆菌（EIEC）,致泻性大肠杆菌,肠毒素性大肠杆菌（ETEC）,致病性大肠杆菌（EPEC）,出血性大肠杆菌（EHEC）,大肠菌群测定的意义,成人粪便中大肠杆菌含量10,8,-10,9 （,个/克）,推测：大肠杆菌 粪便污染 致病菌,一些特殊食品不适用这个原理：,冷冻食品,因为大肠杆菌比致病菌更容易死亡,过程监测：原料、生产、加工、运输、储存,12.2 大肠菌群的测定方法,培养基,乳糖胆盐发酵培养基（试管）、,伊红美蓝琼脂、,乳糖发酵培养基（试管）,革兰氏染液,乳糖胆盐发酵管,配方：,蛋白胨 2 %,猪胆盐（或牛胆盐）0. 5 %,乳糖 1 %,溴甲酚紫酒精液 0 . 06ml,pH,双料乳糖胆盐发酵管：,除蒸馏水外其他成分加倍,原理,溴甲酚紫，,中性时呈蓝紫色,，,酸性时呈黄色,如果颜色不变（呈蓝紫色），说明无产酸的大肠菌群,如果颜色变黄色，说明可能出现能分解乳糖产酸的大肠菌群,胆盐可以抑制,G+,细菌生长繁殖,分解乳糖产酸产气的大肠菌群，看杜氏管中的气体,杜氏发酵管产气情况,1产气 2不产气,伊红美蓝琼脂,EMB,蛋白胨 g 乳糖 g 磷酸氢二钾 2.0g 琼脂 g伊红 0.4g美蓝g 蒸馏水 mL最终0.2,(25),蛋白胨提供细菌生长发育所需的氮源、维生素和氨基酸，乳糖提供发酵所需的碳源，磷酸氢二钾维持缓冲体系，伊红和美蓝抑制绝大部分革兰氏阳性菌的生长。琼脂是凝固剂。,大肠杆菌在EMB上发酵乳糖，形成黑色菌落，大部分有金属光泽。沙门氏菌形成无色菌落。金黄色葡萄球菌基本上不生长。,菌株 菌号 生长情况 菌落,产气肠杆菌 ATCC 13048 好 粉红，无光泽,大肠埃希氏菌 ATCC 25922 好，极好 有紫绿金属光泽中心,肺炎克雷伯氏菌 ATCC 13883 好 绿金属光泽，有黑心,奇异变形杆菌 ATCC 25933 好，极好 无色,鼠伤寒沙门氏菌 ATCC 14028 好，极好 无色,金黄色葡萄球菌 ATCC 25923 被抑制 ,12.3 大肠菌群测定操作流程,（任务一）,梯度稀释样品,大肠菌群测定操作注意事项,1、检验步序：三步法（,乳糖发酵、分离培养、证实实验,），也可称（,初发酵、平板分离、复发酵,）,2、抑菌剂,3、挑选菌落,4、产气量,5、,接种量是指实际接入试管中的、相当于原样品的量,例如：,稀释度1：10 接种10ml，取液量是10ml，但接种量就是1ml(g)，即,相当于原样品的1ml(g),6、接种量若是大于ml的话全部用,双料管,，等于或小于ml用单料管,大肠菌群测定操作注意事项,根据证实为大肠菌群阳性的管数，查,MPN,检索表，报告为：,个/,100mL,（或,g,）,或,MPN/100ml（或g）,12.4 MPN法估计大肠菌群数量,（任务二）,What? MPN (Most Probable Number)?,MPN法是一种常见的,间接计数法,，相对来说，,CFU是直接计数法,MPN法是一种概率估计法，有可信区间， MPN值,并不能表示实际菌落数,，而实际菌落数落在可信区间内的任何一点,MPN值是该区间内,最有可能,的那个值,How? MPN检索表的使用方法,（1）该方法只适用于,连续的10倍稀释,的情况,（2）向发酵管里面接种的接种量指的是,相当于原样品,（液体或固体）的体积或质量，,而不是,稀释后的体积或质量,例如：,的10,3,稀释液的接种量 = 1ml的10,4,稀释液的接种量，因为它们相当于原样品的量是相同的,（3）也,可以不用梯度稀释液来接种,，或者说也可以不用做梯度稀释液，而直接用样品接种,例如，,可以直接向三组发酵管中分别直接加入10g（或ml）、 1g（或ml）、（或ml）样品,（4）初发酵和复发酵的发酵管中,培养基的量,不会影响检验结果，,无关,How? MPN检索表的使用方法,（5）MPN表中的阳性管数,是最终证实实验结果为阳性且革兰氏染色为阴性无芽孢杆菌的管数，,而不是,初发酵时产气的管数,(6) 3个稀释度9支试管，理想情况下，应该让最高稀释度的试管呈阴性，最低稀释度的试管全呈阳性，即,3, x, 0,形式,How? MPN检索表的使用方法,任务二练习：MPN检索表用法,十倍稀释1ml ，百倍稀释1ml ，千倍稀释1ml各三管，都为阴性，结果为,？,MPN/100mL,原样品1ml或十倍稀释10ml ，十倍稀释1ml， 百倍稀释 1ml 各三管，都为阴性，结果为,？,MPN/100mL,原样品10ml ，原样品1ml，十倍稀释1ml 各三管，都为阴性，结果为,？,MPN/100mL,十倍稀释1ml ，百倍稀释1ml ，千倍稀释1ml各三管，都为阴性，结果为300MPN/100mL,原样品1ml或十倍稀释10ml ，十倍稀释1ml， 百倍稀释 1ml 各三管，都为阴性，结果为30MPN/100mL,原样品10ml ，原样品1ml，十倍稀释1ml 各三管，都为阴性，结果为3MPN/100mL,任务二练习：MPN检索表用法,MPN法的隐性成本,但是，让我们看一下90 MPN/100 g的可信区间，为10 360 cfu/100g,也就是说有部分实际菌落数在1030 cfu/100g之间，会被当作不合格产品处理！,假如某产品的大肠菌群国家标准为30 MPN/100 g，,而某厂家的样品的检测结果为90 MPN/100 g,大肠菌群超标,鉴定完毕！,原国家商检局制订的行业标准，等效采用美国FDA的标准方法，用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测,两步法：,推测试验,：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤。361培养482h，观察是否产气。,证实试验,：将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，361培养482h，观察是否产气。以BGLB产气为阳性。查MPN表，报告每ml(g)样品中大肠菌群的MPN值。,水样的检验,一般只检验菌落总数和大肠菌群MPN,只有在流行病学调查时才进行致病菌检验,大肠菌群是水的卫生学指示菌,水样中大肠菌群的检验方法：MPN法（特殊）,- 初发酵、平板分离、复发酵,水中总大肠菌群的测定,多管发酵法,(1),生活饮用水,初发酵试验,平板分离,复发酵试验,阳性管接种在伊红美兰培养基上，,37,培养,18,24h,，挑选典型特征的菌落，涂片、革兰氏染色、镜检,各100mL,原水样,各10mL,37,24h,G,-,G,-,G,+,37,18-24h,37,24h,水中总大肠菌群的测定,(2),水源水：将水样作,1,：,10,稀释,水样,25mL,225mL无菌水,各1mL,各1mL,各10mL,10,-1,37,24h,(3) 地表水和废水：水样应作1:10，1:100，1:1000或更高的稀释,MPN,值,=MPN,指数,水中总大肠菌群的测定,水中总大肠菌群的测定,四管发酵法（以轻度污染者为例）,初发酵试验,平板分离,复发酵试验,革兰氏染色,+,_,+,+,10mL,水样,25mL,225mL无菌水,1mL,1mL,1mL,10,-1,1mL,10,-,2,37,24h,37,18-24h,+,+,+,G,-,G,-,G,+,37,24h,Any questions?,