10 维生素的测定

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第十章 食品中维生素的测定,课程导言,维生素也称维他命，是人体不可缺少的一种营养素。维生素跟酶类一起参与着肌体的新陈代谢，能使肌体的机能得到有效的调节。人体中如果缺少维生素，就会患各种疾病。,3000多年前，当时古埃及人发现夜盲症可以被一些食物治愈，虽然他们并不清楚食物中什么物质起了医疗作用，这是人类对维生素最朦胧的认识。,1519年，葡萄牙航海家麦哲伦率领的远洋船队从南美洲东岸向太平洋进发。三个月后，有的船员牙床破了，有的船员流鼻血，有的船员浑身无力，待船到达目的地时，原来的200多人，活下来的只有35人，人们对此找不出原因。,1734年，在开往格陵兰的海船上，有一个船员得了严重的坏血病，当时这种病无法医治，其他船员只好把他抛弃在一个荒岛上。待他苏醒过来，用野草充饥，几天后他的坏血病竟不治而愈。,诸如此类的坏血病，曾夺去了几十万水手的生命。1747年英国海军军医林德总结了前人的经验，建议海军和远征船队的船员在远航时要多吃些柠檬，他的建议被采纳，从此未曾发生过坏血病。但那时还不知柠檬中的什么物质对坏血病有抵抗作用。,坏血病是由于人体缺乏VC所引起的疾病。长期摄入不足或腹泻、呕吐等情况，都可造成缺乏VC，使胶原蛋白不能正常合成导致细胞联结障碍，使毛细血管的脆性增加，从而引起皮、粘膜下出血，医学上称为坏血病。人工哺乳婴儿及成人食物中长期缺乏新鲜果蔬菜(嗜酒、偏食等)、或长期感染对维生素C需要量增多时，可患本病。,维生素C缺乏后数月，患者全身乏力，精神抑郁、厌食、营养不良，牙龈肿胀、出血，并牙齿松动、脱落，骨关节肌肉疼痛，皮肤淤点、淤斑，毛囊过度角化、周围出血，小儿可因骨膜下出血而致下肢假性瘫痪、肿胀、膝关节半屈，足外旋，蛙样姿势。,随着时间的推移，越来越多的维生素种类被人们认识和发现，维生素成了一个大家族。人们把它们排列起来以便于记忆，维生素按A、B、C一直排列到L、P、U等几十种。,现代科学进一步肯定了维生素对人体的抗衰老、防止心脏病、抗癌方面的功能。,1912年，波兰科学家,丰克,，经过千百次的试验，终于从米糠中提取出一种能够治疗脚气病的白色物质。这种物质被丰克称为 “维持生命的营养素”，简称Vitamin(维他命)，也称维生素。,维生素对人体的作用不同于糖类、蛋白质和脂肪，既不能给体内提供能量，也不是人体中主要组织的成分。,虽然人体对维生素的需要量小，作用却很大。,它的生理作用是主宰体内营养成分的分配，调节体内的生理机能，充当辅助酶素，促进体内各类生物化学反应的顺利进行，促进人体的生长发育,。体内一旦缺少维生素，就会引起物质代谢的紊乱，发生某些疾病。,二、维生素的分类,维生素种类很多，目的已经确认的有30多种，其中被认为对,维持人体健康和促进发育至关重要的有20余种,。,维生素可以根据它们的溶解性分为,水溶性和脂溶性,两大类。然后将作用相近的归为一族，在一族里含有多种维生素时，再按其结构标上1、2、3等数字。,脂溶性维生素包括维生素A、D、E、K等。,水溶性维生素包括B族维生素中的B,1,、B,2,、B,3,、B,6,、B,12、,生物素、叶酸、泛酸、胆碱以及维生素C等。,三、维生素的性质与提取,（一）脂溶性维生素的性质,1、,溶解性,：脂溶性维生素不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂；,2、,酸碱稳定性,：,VA、VD对酸不稳定，对碱稳定；VE对酸稳定，对碱不稳定,；,3、,光热稳定性,：,VA、VD、VE耐热性好,；,VA,因分子中有双链，,易被氧化，光、热可促进其氧化,；VD性质稳定，不易被氧化，,VE,在空气中能慢慢被氧化，,光、热、碱能促进其氧化作用,。,（二）脂溶性维生素的提取,皂化处理水洗除脂有机溶剂提取浓缩,在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，常,加入抗氧化剂,（如焦性没食子酸、维生素C等）；对于某些液体试样或脂肪含量低的试样，可以先用有机溶剂,抽出脂类,，然后再进行,皂化处理,；对于维生素A、D、E共存的试样，或杂质含量高的试样，在皂化提取后，还需进行,层析分离,。分析操作一般要在,避光,的条件下进行。,（三）水溶性维生素的性质,1、,溶解性,：易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂；,2、,酸碱稳定性,：,在酸性介质中稳定,，即使加热也不破坏；但,在碱性介质中不稳定,，易于分解，特别在碱性条件下加热，可大部或全部破坏；,3、,光热稳定性,：,它们易受空气、光、热、酶、金属离子等影响,，,VB,2,对光，特别是紫外线敏感，VC对氧、铜离子敏感，易被氧化,。,（四）水溶性维生素的提取,测定水溶生维生素时，一般都在,酸性溶液中进行,前处理。,VB,1,、VB,2,通常采用酸水解，或在经淀粉酶、木瓜蛋白酶等酶解作用，使结合态维生素游离出来，再将它们从食物中提取出来。,VC通常采用草酸或草酸-醋酸直接提取。,在一定浓度的酸性介质中，可以消除某些还原性杂质对维生素的破坏。,四、维生素测定的意义,随着营养知识的普及，维生素在日常膳食及其在食品加工中的重要地位越来越受到重视，,我们在评价食品的营养价值，开发利用高含量维生素的食品资源，指导人们合理调整膳食结构，指导制定加工工艺或贮存条件，最大限量地保留各种维生素，还要控制强化食品中加入量，防摄入过多的维生素而引起中毒，都离不开分析检测工作。,所以，测定食品中维生素在营养分析方面具有重要的意义。,10-2 维生素C的测定,一、维生素C的结构和性质,VC是一种己糖醛基酸,化学名称为：L-3-氧代苏己糖醛酸内酯,英文名：Vitamin C ，Ascorbic Acid,维生素C为无色晶体，难溶于脂肪，易溶于水，其水溶液具有酸性，,对酸稳定，遇碱或遇热极易破坏，具有较强的还原性，易氧化，铜盐可促进其氧化,。,维生素C广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜。特别是鲜枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑橘等食品中含量尤为丰富。,自然界存在两种形式的VC：,抗坏血酸（还原型VC）和脱氢抗坏血酸（氧化型DHVC,），VC具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性。进一步水解则生成,2，3二酮古乐糖酸,，失去生理作用。在食品中，这三种形式均有存在，但主要是前两者，故,许多国家的食品成分表均以抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量表示,。,二、 2，6-二氯靛酚滴定法,1、原理,2、6-二氯靛酚,是一种染料，其颜色反应表现为两种特性。一是取决于氧化还原状态，氧化态为深蓝色，还原态为无色；二是受其介质酸度的影响，在碱性介质中呈深蓝色，在酸性溶液介质中呈浅红色。,用蓝色的碱性染料标准液，滴定含维生素C的酸性浸出液，染料被还原为无色，到达终点时，稍微过量的2、6-二氯靛酚染料在酸性溶液中呈浅红色即为终点。从染料消耗量即可计算出试样中还原型抗坏血酸量。,本标准适用于果品、蔬菜及其加工制品中还原型抗坏血酸的测定(不含二价铁、二价锡、一价铜、二氧化硫、亚硫酸盐或硫代硫酸盐)，不适用于深色样品。,2、适用范围,3、试剂,（1）,浸提剂,偏磷酸溶液（20g/L）,草酸溶液（20g/L）,（2）抗坏血酸标准溶液(1mg/mL)：称取100mg（准确至0.1mg）抗坏血酸，溶于浸提剂中并稀至100mL。,现配现用,。,（3）白陶土(或称高岭土): 对维生素C无吸附性。,（4）2，6-二氯靛酚标准溶液,称取碳酸氢钠52mg溶解在200mL热蒸馏水中，然后称取2，6二氯靛酚50mg溶解在上述碳酸氢钠溶液中。冷却定容至250mL，过滤至,棕色瓶内,，保存在冰箱中。,每次使用前，用标准抗坏血酸标定其滴定度,。即吸取1mL 抗坏血酸标准溶液于250mL锥形瓶中，加人10mL浸提剂，摇匀，用2，6二氯靛酚溶液滴定至溶液呈粉红色15s不褪色为止。同时，另取10ml浸提剂做空白试验。,滴定度计算:,式中：,T滴定度，每毫升2，6二氯靛酚溶液相当于抗坏血酸的毫克数，mg/mL；,C抗坏血酸的浓度，mg/mL；,V吸取抗坏血酸的体积，mL；,V,1,滴定抗坏血酸溶液所用2，6二氯靛酚溶液的体积，mL；,V,2,滴定空白所用2，6二氯靛酚溶液的体积，mL。,4、测定步骤,（1）试样制备,称取具有代表性试样的可食部分100g，置于组织捣碎机中，加入100mL,浸提剂,，迅速搅拌成匀浆。称取10g40g浆状样品于烧杯中，用浸提剂将试样移入100mL容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，过滤，取中间滤液备用。,若滤液有色，可按每克试样加0.4g,白陶土脱色,后再过滤。,（2）测定,吸取试样处理滤液10mL，于50mL锥形瓶中，用已标定过的2，6-二氯靛酚溶液滴定，直至溶液出现,微红色,15s不褪为终点。,同时做空白试验。,5、结果计算,式中:,X试样中维生素C含量，mg/100g；,V滴定样液时消耗染料溶液的体积，mL；,V,0,滴定空白时消耗染料溶液的体积，mL；,T2，6-二氯靛酚染料滴定度，mg/mL；,A稀释倍数；,W一样品质量，g。,6、说明,1）本法测定的结果为食品中的,还原型L-抗坏血酸含量，而非VC总量。不适用于深色样品,。,2）维生素C在酸性条件下较稳定，故,试样处理或浸提都应在弱酸性环境中进行,。浸提剂以偏磷酸 （HPO3） 稳定维生素C效果最好，但价格较贵。一般可采用草酸（20g/L）代替偏磷酸，价廉且效果也较好。,3）整个,操作过程应迅速,，避免还原型抗坏血酸被氧化。,三、荧光法,GB/T 5009.86-2003蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定（第一法）,（一）原理,试样中,还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸,后，与,邻苯二胺 （OPDA） 反应生成有荧光的喹唔啉,（quinoxaline）。其荧光强度与抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食品中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。,脱氢抗坏血酸与,硼酸,可形成复合物而不与OPDA反应，以此,排除,试样中荧光杂质产生的,干扰,。,（二）试剂,1、,偏磷酸-乙酸液,：称取15g偏磷酸，加入40mL冰乙酸及250mL水，加温、搅拌，使之逐渐溶解，冷却后加水至500mL。于4冰箱可保存7d10d。,2、,偏磷酸-乙酸-硫酸液,：称取15g 偏磷酸，加入40mL冰乙酸及250mL 0.15 mol/L 硫酸液，加温，搅拌，使之逐渐溶解，冷却后加0.15mol/L硫酸液至500mL。,3、,硼酸-乙酸钠溶液,：称取3g硼酸，溶于100mL乙酸钠（500g/L）溶液中，临用前配制。,4、,邻苯二胺溶液,（200mg/L）：称取20mg邻苯二胺，临用前用水稀释至100mL。,5、,抗坏血酸标准使用液,（100g/mL）,6、,0.04%百里酚蓝指示剂溶液,：称取0.1g百里酚蓝，加0.02mol/L氢氧化钠溶液，在玻璃研钵中研磨至溶解，氢氧化钠的用量约为10.75mL，磨溶后用水稀释至250mL。,变色范围：,pH1.2时为红色；,pH2.8时为黄色；,pH 4为蓝色。,7、,活性炭的活化,：加200g炭粉于1L盐酸（1:9）中，加热回流1h2h，过滤，用水洗至滤液中无铁离子为止，置于110120烘箱中干燥，备用。,（三）仪器,荧光分光光度计,（四）操作方法,1、试样的制备,称取100g鲜样，加100mL偏磷酸-乙酸溶液，倒入捣碎机内打成匀浆，用百里酚蓝指示剂调式匀浆酸碱度。,如显红色，即可用偏磷酸-乙酸溶液稀释，如呈黄色或蓝色，则用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释,，使其,pH为1.20,。,匀浆的取量需根据试样中抗坏血酸的含量而定。当试样液含量在40g/mL100g/mL之间，一般取20g匀浆，用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100mL。过滤，滤液备用。,2、测定,（1）氧化处理：分别取上述试样滤液及抗坏血酸标准使用液（100g/mL）各100mL于200mL具塞锥形瓶中，加2g活性炭，用力振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液，分别收集其余全部滤液，即试样氧化液和标准氧化液，待测定。,（2）各取10mL标准氧化液于2个100mL容量瓶中，分别标明“标准”及“标准空白”。,（3）各取10mL试样氧化液于2个100mL容量瓶中，分别标明“试样”及“试样空白”。,（4）于“标准空白”及“试样空白”中各加5mL,硼酸-乙酸钠溶液,，混合摇动15min，用水稀释至100mL，在4冰箱中放置2h3h，即得“标准空白”及“试样空白”溶液，取出备用。,（5）于“试样”及“标准”中各加5mL 500g/L乙酸钠溶液，用水稀释至100mL，即得“试样”溶液及“标准”溶液（10g/mL），备用。,3、标准曲线的制备,4、荧光反应,取“标准空白”溶液、“试样空白”溶液及“试样”溶液各2mL，分别置于10mL带盖试管中，连同标准系列，在暗室迅速向各管中加入5mL邻苯二胺溶液，振摇混合，在室温下反应35min，于激发光波长328nm、发射光波长420nm处测定荧光强度。标准系列荧光强度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标，对应的抗坏血酸含量为横坐标，绘制标准曲线或进行相关计算。,（五）结果计算,式中：,X试样中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量，mg/100g；,C由标准曲线查得或由回归方程算得试样溶液浓度，g/mL；,m试样质量，g；,V荧光反应所用试样体积，mL；,F试样溶液的稀释倍数。,1、,本法适用于蔬菜、水果及其制品中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量,。本法检出限为5g/mL20g/mL。,2、影响荧光强度的因素很多，各次测定条件很难完全再现，因此，,标准曲线最好与样品同时做,。,（六）说明,四、2，4-二硝基苯肼法,GB/T 5009.86-2003蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定（第二法）,（一）原理,总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮乐古糖酸。试样中的还原型抗坏血酸经酸性活性炭氧化为脱氢型抗坏血酸，再与2，4-二硝基苯肼作用，生成红色的脎,。脎的量与总抗坏血酸含量成正比，将红色脎溶于硫酸后进行比色，由标准曲线计算试样中总抗坏血酸含量。,（二）试剂,1、,4.5mol/L硫酸和85%硫酸,2、,2，4-二硝基苯肼溶液（20g/L）,：溶解2g 2，4二硝基苯肼于100mL 4.5mol/L硫酸溶液中，过滤。不用时存于冰箱内，每次用前必须过滤,3、,草酸溶液（20g/L与10g/L）,4、,硫脲溶液（10g/L与20g/L ）,：溶解5g（10g）硫脲于500mL上述草酸溶液（10g/L）中,5、,1mol/L盐酸溶液,6、,VC标准溶液,：称取100mg纯VC溶解于100mL草酸溶液（20g/L）中。此溶液每毫升相当于1mg VC,7、,活性炭,（三）仪器,1、恒温箱：370.5；,2、可见-紫外分光光度计；,3、捣碎机,（四）操作方法,1、试样制备（全部实验过程要避光）,（1）鲜样制备,：称取100g鲜样及吸取100mL 20g/L草酸溶液，倒入捣碎机中打成匀浆。取1040g匀浆（含12mg抗坏血酸）转移到100mL容量瓶中，用10g/L草酸溶液稀释至刻度，混匀。,（2）干样制备,：称取试样1g4g（含1mg2mg抗坏血酸）放入乳钵内，加入10g/L草酸溶液磨成匀浆，转入100mL容量瓶内，用10g/L草酸溶稀释至刻度，混匀。,（3）液体试样,：直接取样（约含1mg2mg抗坏血酸）用10g/L草酸溶液定容至100mL。,将试样溶液过滤，滤液备用。不易过滤的试样可用离心机离心后，倾出上层清液，过滤，备用。,2、氧化处理,吸取25mL上述滤液于锥形瓶中，加入活性炭2g，振摇1min，过滤。弃去数毫升初滤液。取10mL此氧化提取液，加入10mL 20g/L硫脲溶液，混匀，此试样为稀释液。,3、呈色反应,（1）于三个试管中各加入4mL氧化处理后的稀释液，一个试管作空白，在其余试管中加入1.0mL 2，4-二硝基苯肼溶液（20g/L），将所有试管放入370.5恒温箱或水浴中，保温3h。,（2）3h后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中。空白管取出后使其冷到室温，然后加入1.0mL 2，4-二硝基苯肼溶液（20g/L），在室温中放置10min15min后放入冰水内，其余步骤同试样。,4、85%硫酸处理,当试管放入冰水后，向每一试管中加入5mL硫酸（85%），滴加时间至少需要1min，需边加边摇动试管。将试管自冰水中取出，在室温放置30min后比色。,5、比色,用1cm比色杯，以空白液调零点。于波长500nm处测定吸光值。,6、标准曲线的绘制,（1）加2g活性炭于50mL抗坏血酸标准溶液中，振摇1min，过滤。,（2）取10mL滤液放入500mL容量瓶中，加5.0g硫脲，用10g/L草酸溶液稀释至刻度，此溶液抗坏血酸浓度为20g/mL。,（3）取5、10、20、25、40、50、60mL上述稀释液，分别放入7个100mL容量瓶中，用10g/L硫脲溶液稀释至刻度，得一标准系列。每个容量瓶中最后稀释液对应的抗坏血酸浓度分别为1、2、4、5、8、10、12g/mL。,以下同前,（五）计算,式中：,X试样中总抗坏血酸的含量，mg/100g；,C由标准曲线查得或由回归方程算得“试样氧化液”中总抗坏血酸的浓度，g/mL；,V试样用10g/L草酸溶液定容的体积，mL；,F试样氧化处理过程中的稀释倍数；,m试样质量，g,（六）说明,1、 加入,硫脲可防止抗坏血酸氧化,，且,有助于促进脎的形成,。最后溶液中硫脲的浓度要一致，否则影响测定结果。,2、 加入硫酸后显色，因糖类的存在会造成显色不稳定，30min后影响将减少，故,加硫酸30min后方可比色,。,3、 于,冰浴,上加入,硫酸需一滴一滴加入,，边加边摇，若加得过快，温升过高，将使糖类炭化产生焦糖色，影响测定结果。溶液温度需保持10以下。,4、,活性炭,对抗坏血酸的氧化作用，是基于其表面吸附的氧进行界面反应，加入量过低，氧化不充分，测定结果偏低；加入量过高，对抗坏血酸有吸附作用，也使结果偏低。,5、本法为GB/T5009. 86-2003蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定中的第二法，,适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸（还原型、脱氢型和二酮古糖酸）的测定,。本法检出限为1g/mL12g/mL。,五、分光光度法,荧光法和2，4-二硝基苯肼法,测定的是氧化脱氢型抗坏血酸，,不能测定其主要成分还原型抗坏血酸,，而且,局限于果蔬类试样,，操作非常繁琐；,对营养强化食品、蛋白食品等试样的测定更不适应,。,（食品中还原型抗坏血酸的测定GB/T 5009.159-2003 ）,（一）原理,在乙酸溶液中，,抗坏血酸,与,固蓝盐B,反应生成,黄色,的草酰肼-2-羟基丁酰内酯衍生物。在最大吸收波长420nm处测定吸光度，与标准系列比较定量。,1、乙酸溶液（2mol/L与0.5mol/L）,（二）试剂,2、乙二胺四乙酸二钠溶液（0.25mol/L）,3、蛋白沉淀剂,（1）乙酸锌溶液（220g/L）,（2）亚铁氰化钾溶液（106g/L）,4、显色剂：,固蓝盐B,（Fast Blue Salt B）溶液（2g/L）,5、抗坏血酸标准溶液（0.1g/L）,（三）仪器,1、分光光度计,2、捣碎机,3、离心机,4、10mL具塞玻璃比色管,（四）分析步骤,1、试样溶液的制备,（1）非蛋白性食品,液体试样,：抗坏血酸含量在0.2 g/L以下的试样，混匀后可直接取样测定；抗坏血酸含量在0.2g/L以上的试样，用水适量稀释后测定。,水溶性固体试样,：准确称取1.0g5.0g，精确至0.001g（含0.2g/kg以下抗坏血酸）放人乳钵中，加5mL乙酸溶液（2mol/L）研磨溶解后，移入100mL棕色容量瓶内，加水稀释至刻度。,蔬菜、水果,：称取鲜样可食部分20.0g50.0g于捣碎机内，加同倍量的乙酸溶液（2mol/L）捣成匀浆。称取10.0g20.0g匀浆（含0.2g/kg以下抗坏血酸）于100mL棕色容量瓶内，加5mL乙酸溶液（2mol/L），用水稀释至刻度，混匀。,用滤纸过滤，滤液备用。不易过滤的试样可用离心机离心后，上清液供测定。,（2）蛋白性食品（奶粉、豆粉、乳饮料、强化食品等）,固体试样,：混匀后精密称取5.0g10.0g，精确至0.001g；,液体试样,：用移液管精密吸取5.0mL10.0mL于100mL棕色容量瓶内。,加10mL乙酸溶液（2mol/L）、乙酸锌溶液（220g/L）和亚铁氰化钾溶液（106 g/L）各7.5mL，加水至刻度，混匀。将全部溶液移入离心管内，以3000r/min离心10min，上清液供测定。,同时取与处理试样,相同量的乙酸溶液、乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液，按同一方法做试剂空白试验,。,2、标准曲线的绘制,精密吸取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0mL抗坏血酸标准使用溶液（相当于抗坏血酸0，10.0，20.0，40.0，60.0，80.0，100.0，150.0，200.0g），分别置于10mL比色管中。各加0.3mL乙二胺四乙酸二钠溶液（0.25mol/L）、0.5mL乙酸溶液（0.5mol/L）、1.25mL固蓝盐B溶液（2g/L），加水稀释至刻度，混匀。室温（2025）下放置20min后，移入1cm比色皿内，以零管为参比，于波长420nm处测量吸光度，以标准各点吸光度绘制标准曲线。,3、试样测定,非蛋白性试样的测定,蛋白性试样的测定,：精密吸取按上述蛋白性食品制备的试样溶液（约相当于抗坏血酸200g以下）和等量试剂空白溶液（0.5mL5.0mL），各于10mL比色管内。各加1.5mL乙二胺四乙酸二钠溶液（0.25mol/L），1.0mL乙酸溶液（0.5mol/L），1.25mL固蓝盐B溶液（2g/L），加水稀释至刻度，混匀。室温（2025）下放置3min后，移入1cm比色皿内，以,试剂空白管,为参比，于波长420nm处测量吸光度。试样吸光度从标准曲线上查出抗坏血酸含量。,（五）结果计算,式中:,X试样中抗坏血酸的含量，mg/100g（mg/100mL）；,c试样测定液中抗坏血酸的含量，g；,m试样质量（体积），g（mL）；,V,2,试样处理液总体积，mL；,V,1,测定时所取溶液体积，mL。,（六）说明,本法,适用于各类食品中还原型抗坏血酸的测定,。该法具有灵敏度高、准确度好、操作简便、快速、应用范围广等特点。但不适用于脱氢型抗坏血酸的测定。,10-3 维生素A的测定,一、维生素A的结构和性质,维生素A（vitamin A）又称视黄醇,（,其醛衍生物视黄醛,）是一个具有酯环的不饱和一元醇，包括维生素A,1,、A,2,两种（维生素A1和A2 结构相似），属脂溶性维生素。,维生素A只存在于动物性食物中，A,1,主要存在于哺乳动物及咸水鱼的肝脏中；A,2,主要存在于淡水鱼的肝脏中。植物组织中尚未发现维生素A。人体缺乏维生素A，影响暗适应能力，如儿童发育不良、皮肤干燥、干眼病、夜盲症等。,视黄醇可由植物来源的-胡萝卜素合成，在体内-胡萝卜素-15，15-双氧酶（双加氧酶）催化下，可将-胡萝卜素转变为两分子的视黄醛，视黄醛在视黄醛还原酶的作用下还原为视黄醇。故,-胡萝卜素也称为维生素A 原,。,富含维生素A的食物有两类：,一是维生素A原，即各种胡萝卜素,，存在于植物性食物中，如绿叶菜类、黄色菜类以及水果类，含量较丰富的有菠菜、苜蓿、豌豆苗、红心甜薯、胡萝卜、青椒、南瓜等；,另一类是来自于动物性食物的维生素A,，这一类是能够直接被人体利用的维生素A，主要存在于动物肝脏、奶及奶制品（未脱脂奶）及禽蛋中。,维生素A性质：,1.,溶解性,：不溶于水，易溶于有机溶剂。,2.,稳定性,：易,被氧化剂氧化，易被紫外光裂解,。在缺氧情况下，对热较稳定，对光特别敏感。,维生素A对碱稳定,。,3.,紫外吸收特性,：在,紫外光区有强吸收,，可用于鉴别和含量测定。,4.,与三氯化锑呈色,：维生素A在氯仿溶液中与,三氯化锑试剂作用,，,产生不稳定的蓝色,。,二、维生素A的提取,1. 试样用有机溶剂萃取脂类,试样可以根据脂肪的测定处理脂肪，即,索氏抽提法,，采用乙醚作提取剂，也可用热苯回流方法提取脂类。如果试样中含蛋白质和淀粉多的情况下可采用乙醚提取法。,脂类有维生素和脂肪这两部分通过皂化（50% KOH、无水甲醚、热回流）把它们分开，得到一部分皂化物和一部分不皂化物。,2. 脂类的皂化,皂化温度与时间：70、30min。,3. 提取,皂化后经水、苯、乙醚萃取可得到不皂化物。,4. 柱层析分离,采用柱层析分离干扰物质，如果柱层析把-胡萝卜素也洗脱下来，那么这时维生素A与-胡萝卜素就是一个混合物，还要将它们分离开。如果试样中只有维生素A而不含-胡萝卜素时，这时可直接定容。,5. 维生素A与-胡萝卜素分离,吸附剂： 8份中性Al,2,O,3,和2份碱性Al,2,O,3,混合，装柱分离方法：用2%丙酮石油醚洗-胡萝卜素；用乙醚洗VA。,三、维生素A的测定比色法,（一）原理,维生素A在三氯甲烷中与三氯化锑相互作用，产生蓝色物质,，其深浅与溶液中所含维生素A的含量成正比。该蓝色物质虽不稳定，但在一定时间内可用分光光度计于620nm波长处测定其吸光度。,（二）试剂,1、无水硫酸钠,2、乙酸酐,3、乙醚,4、无水乙醇,5、三氯甲烷,6、三氯化锑三氯甲烷溶液(250g/L)：用三氯甲烷配制三氯化锑溶液，储于棕色瓶中。,7、酚酞指示剂(10g/L),8、维生素A或视黄醇乙酸酯标准液,（1）配制：,视黄醇,(纯度85%)或,视黄醇乙酸酯,(纯度90%)经皂化处理后使用。用脱醛乙醇溶解维生素A标准品，使其浓度大约为1mL相当于1mg视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。,（2）维生素A标准浓度的标定：取维生素A标准液10.00L，用乙醇稀释至3.00mL，在325nm波长处测定其吸光度值。用比吸光系数计算出维生素A的浓度。,式中：,X维生素A的浓度；,维生素A的平均紫外吸光值；,1835维生素A（1）比吸光系数；,K标准稀释倍数,（三）仪器,1、实验室常用仪器,2、分光光度计。,3、回流冷凝装置。,1、试样处理（根据试样性质，可采用,皂化法或研磨法,）,（四）分析步骤,维生素A极易被光破坏，实验操作应在微弱光线下进行，或用棕色玻璃仪器。,（1）皂化法：适用于维生素A含量不高的试样，可减少脂溶性物质的干扰,，但全部试验过程费时，且易导致维生素A损失。,皂化,：根据试样中维生素A含量的不同，准确称取0.5g5g试样于三角瓶（磨口与冷凝器连接）中，加入10mL氢氧化钾及2040mL乙醇，于电热板上回流30min至皂化完全为止。,脂类物质水溶性物质,。 VA与脂类物质可根据其溶解性分开。,提取,：将皂化瓶（即以上的三角瓶）内混合物移至分液漏斗中，以30mL水洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗。用50mL乙醚分二次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。振摇并注意放气，静置分层（醚层在上，水层在下）后，水层（含皂化物）放入第二个分液漏斗内。皂化瓶再用约30mL乙醚分二次冲洗，洗液倾入第二个分液漏斗中。振摇后，静置分层，水层放入三角瓶中，醚层（含VA）与第一个分液漏斗合并。重复至水液中无维生素A为止 (第二个分液漏斗中的醚层不再使三氯化锑氯仿液呈蓝色) 。,试样中的VA全部进入第一个分液漏斗中。,洗涤,：用约30ml水，加入第一个分液漏斗中，轻轻振摇，静置片刻后，放去水层。加1520mL 0.5mol/L 氢氧化钾溶液于分液漏斗中，轻轻振摇后，弃去下层碱液，除去醚溶性酸皂。继续用水洗涤，每次用水约30mL，直至洗涤液与酚酞指示剂呈无色为止(大约3次)。醚层液静置1020min，小心放出析出的水。,进一步除去脂肪等杂质，净化醚层中的VA。,浓缩,：将醚层液经过无水硫酸钠滤入三角瓶中，再用约25mL乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠两次，洗液并入三角瓶内。置水浴上蒸馏，回收乙醚。待瓶中剩约5mL乙醚时取下，用减压抽气法至干，立即加入一定量的三氯甲烷使溶液中维生素A含量在适宜浓度范围内。,（2）,研磨法：适用于每克试样维生素A含量大于5g10g试样的测定，如动物肝的检测,。步骤简单、省时、结果准确。,研磨,：精确称取2g5g试样，放入盛有35倍试样质量的无水硫酸钠研钵中，研磨至试样中水分被完全吸收，并均质化。,提取,：小心地将全部均质化试样移入具塞三角瓶内。精确加入50mL100mL乙醚，紧压塞子，用力振摇2min，使试样中维生素A溶于乙醚中，使其自行澄清 (大约需1h2h)，或离心澄清 。,浓缩,：取澄清乙醚液2mL5mL，放入比色管中，在7080水浴上抽气蒸干，立即加入1mL三氯甲烷溶解残渣。,2、标准曲线测定,准确吸取维生素A标准液0.00、0.10mL、0.20mL、0.30mL、0.40 mL、0.50mL于6个10mL棕色容量瓶中，以三氯甲烷定容，得标准系列使用液。,再取相同数量的3cm比色皿顺次移入标准系列使用液各1mL，每个比色皿中加乙酸酐一滴，制成标准比色列。于620nm波长处，以10mL三氯甲烷加1滴乙酸酐调节吸光度至零点，将标准比色列按顺序移入光路前，迅速加入9mL三氯化锑-氯仿溶液，于6s内测定吸光度，绘制标准曲线。,3、试样测定,取2个3cm比色皿，分别加入1mL三氯甲烷 (试样空白液)和1mL样液，各加1滴乙酸酐。其余步骤同标准曲线绘制。,（五）结果计算,式中：,X试样中维生素A的含量，mg/100g；,C由标准曲线上查得试样中维生素A的含量，g/ mL；,V提取后用三氯甲烷定容之体积，mL；,m试样质量，g。,100以每100g试样计。,四、紫外分光光度法,VA为脂溶性的，测定VA时必须先将试样中的脂肪抽提出来进行皂化，萃取不皂化部分，在经柱层析除去杂质等干扰物质，,维生素A的异丙醇溶液在325nm波长下有最大吸收峰，且其吸光度值与维生素A含量成正比,。,1、原理,2、仪器 紫外分光光度计,3、试剂,（1）维生素A标准溶液（40 IU/mL ）,（2）异丙醇,4、操作方法,（1）标准曲线的绘制,分别吸取维生素A标准溶液（40 IU/mL）0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、4.0mL于10mL棕色容量瓶中，以异丙醇定容。于紫外分光光度计325nm处测定吸光度，并绘制标准曲线。,（2）试样的测定,提取皂化层析-胡萝卜素和VA,以石油醚为空白，准确称取适量试样，加异丙醇定容，于紫外分光光度计325nm处测吸光度。,5、计算,式中：X试样中维生素A的含量，IU/100g；,C由标准曲线查得维生素A的含量，IU/ mL；,V试样加入异丙醇定容的体积，mL；,m试样质量，g。,紫外分光光度法操作简便，灵敏度较比色法高，可测定维生素含量低于5g/g的食品。但由于在维生素A的最大吸收波长325nm附近许多其它化合物也有吸收，干扰其测定。,故本法多适用于透明鱼油、维生素A浓缩产物等纯度较高的试样,。,6、说明,10-4 食品中胡萝卜素的测定,GB/T 5009.83-2003 食品中胡萝卜素的测定,一、概述,胡萝卜素是一种广泛存在于有色蔬菜和水果中的天然色素，有多种异构体和衍生物，总称为,类胡萝卜素,，其中在分子结构中含有-紫罗宁残基的类胡萝卜素，在人体内可转变为维生素A，故称为,维生素A原,。如、胡萝卜素，其中以-胡萝卜素效价最高。,二、胡萝卜素的性质和提取,胡萝卜素对热及酸、碱比较稳定，但紫外线和空气中的氧可促进其氧化破坏,。因系脂溶性维生素，故可用有机溶剂从食物中提取。,胡萝卜素原只存在于植物性食品中，但以含有胡萝卜为食物的家禽、兽类、水产动物及其加工产品，以及为着色而添加胡萝卜素的食品，也含有胡萝卜素。,胡萝卜素本身是一种色素，在450 nm 波长处有最大吸收，故只要能完全分离，便可定性和定量。但在植物体内，胡萝卜素经常与叶绿素、叶黄素等共存，在提取胡萝卜素时，这些色素也能被有机溶剂提取，因此在测定前，必须将胡萝卜素与其它色素分开。,常用的方法有纸层析、柱层析和薄层层析法,。,胡萝卜素是人体重要营养素，它是维生素A的前体，是保健食品的重要成分，,6g -胡萝卜素相当于1g 维生素A,。,GB/T 5009.83-2003,第一方法HPLC；第二方法为纸层析法。,（一）高效液相色谱法,三、胡萝卜素的测定方法,试样中的-胡萝卜素，用石油醚+丙酮(8020)混合液提取，经三氧化二铝柱纯化，然后以高效液相色谱法测定，以保留时间定性，峰高或峰面积定量。,（二）纸层析法,1、原理,试样经过皂化后，用石油醚提取食品中的胡萝卜素及其他植物色素，以石油醚为展开剂进行纸层析，胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其他色素分离，剪下含胡萝卜素的区带，洗脱后于450 nm波长下定量测定。,2、试剂,（1）石油醚：沸程3060 :同时是展开剂,（2）氢氧化钾溶液：取50g氢氧化钾溶于50 mL水,（3）无水硫酸钠,（4）无水乙醇：不得含有醛类物质,（5） -胡萝卜素标准液,4、分析步骤,以下步骤需在避光条件下进行。,1）样品预处理,皂化、洗涤、浓缩、定容。,2）纸层析,(1) 点样,：在18cm*30cm滤纸下端距底边4cm处作一基线，在基线上取A、B、C、D四点（如图），吸取0.1-0.4mL浓缩液在AB和CD间迅速点样。,（2）展开,：待纸上所点样液自然挥发干后，将滤纸卷成圆筒状，置于预先用石油醚饱和的层析缸中，进行上行展开。,（3）洗脱,：待胡萝卜素与其他色素完全分开后，取出滤纸，自然挥发干石油醚，将位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带剪下，立即放人盛有5mL，石油醚的具塞试管中，用力振摇，使胡萝卜素完全溶入试剂中。,5、结果计算,3）测定,用1cm比色杯，以石油醚调零点，于450nm波长下，测吸光度值。以其值从标准曲线上查出胡萝卜素的含量，供计算时使用。,10-5 食品中维生素B,1,的测定,一、概述,维生素B1又称硫胺素,（thiamine）或抗神经炎素。由嘧啶环和噻唑环结合而成的一种B族维生素。,易吸收水分。遇光和热效价下降。在酸性溶液中很稳定，在碱性溶液中不稳定，易被氧化和受热破坏,。,维生素B1主要存在于种子的外皮和胚芽中，如米糠和麸皮中含量很丰富，在酵母菌中含量也极丰富。瘦肉、白菜和芹菜中含量也较丰富。,食物中的维生素B1有三种形式，即游离形式、硫胺素焦磷酸脂和蛋白磷酸复合物。,硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成噻嘧色素，在紫外线照射下，噻嘧色素发出荧光,。在给定的条件下，以及没有其他荧光物质干扰时，此荧光之强度与噻嘧色素量成正比，即与溶液中硫胺素量成正比。如试样中含杂质过多，应经过离子交换剂处理，使硫胺素与杂质分离，然后以所得溶液作测定。,二、食品中维生素B,1,的测定,食品中维生素B,1,的测定方法有,荧光分光光度法,、荧光计法、荧光目测法、高效液相色谱法等。,思考题,1、VC测定的方法、原理、基本过程,2、VA、胡萝卜素、VB,1,的测定原理,