结核病实验室生物安全及菌株运输

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,结核病实验室生物安全及菌株运输,1,内 容,一、结核病实验室生物安全,二、结核菌株或样本运输,三、风险评估,2,一、结核病实验室生物安全,3,结核杆菌的生物学性状,1、结核杆菌为细长,略带弯曲,的杆菌，约,1-40.3-0.6m,，,常聚集成团，牛型比人型略粗短；,2、分枝杆菌属的细菌,细胞壁脂质,含量较高，约占干重的,60%，特别是其中的大量分枝菌酸可影响染料的穿入；,3、一般用,萋-尼（Ziehl Neelsen）,抗酸性染色法，以,5%石炭酸复红,加温染色后可以染上，但着色后不易被盐酸酒精脱色；,4,结核杆菌的生物学性状,4、若再加用,美蓝,复染，则分枝杆菌呈,红色,，而其它细菌及,背景中的物质为,蓝色,；,5、专性需氧，最适温度为,37,，低于30或高于42均不,生长；营养要求较高，生长缓慢，初次分离需要营养丰,富的培养基。常用的有,Lowenstein-Jensen培养基,，内,含蛋黄、甘油、无机盐和孔雀绿等。,6、细胞壁的脂质含量较高，影响营养物质吸收，故,生长缓,慢,，在一般培养基中每分裂一代需要10多个小时，在人,体内需,24-36小时,；,5,结核杆菌的生物学性状,7、一般,10-30天,可见菌落生长，菌落呈颗粒、结节或花菜,状，乳白色或米黄色，不透明；,8、结核杆菌细胞壁中含有大量脂质，可防止菌体水分的丢,失，故对,干燥的抵抗力特别强,，沾附在尘埃上保持传染,性8-10天，在干燥痰内可存活,6-8个月,；,9、结核杆菌对,湿热敏感,，在液体中,加热62-63,后,15分钟,或,煮沸,即被杀死；,6,结核杆菌的生物学性状,10、结核杆菌对,紫外线敏感,，直接日光照射,数小时,可被杀,死，可用于结核患者衣服、书籍等的消毒；,11、结核杆菌的抵抗力与环境中,有机物,的存在有密切关系，如,痰液,可增强结核杆菌的抵抗力，因大多数消毒剂可使痰中的,蛋白质凝固,，包在细菌周围，使细菌不易被杀死；,12、,5%的石炭酸,在无痰时,30分钟,可杀死结核杆菌，有痰时需要,24小时,；,5%的来苏儿,无痰时,5分钟,杀死结核杆菌，有痰时需要,1-2小时,；,7,结核杆菌的生物学性状,13、结核杆菌对酸（,3%HCL,）或碱（,4%NaOH,）有抵抗力，,15分钟,不受影响，可在分离培养时用于处理有杂菌污染的标本和消化标本中的粘稠物质；,14、结核杆菌对,1：75000结晶紫,或,1：13000孔雀绿,有抵抗力，加在培养基中可抑制杂菌生长；,15、结核杆菌对链霉素、异烟肼、利福平、环丝氨酸、乙胺丁醇、卡拉霉素、对氨水杨酸等,敏感,，但长期用药容易出现,耐药性,，而吡嗪酰胺的,耐药性5%,。,8,实验室安全操作,原则,1、实验室应按等级要求,完善实验设施,，如生物安全柜的抽,风排风功能、紫外灯消毒、生物安全柜内的除菌滤膜定,期更换等；,2、普通实验室应,注意气流方向,，实验过程中尽量避免强气,流变化而产生气溶胶（如：人员走动等 ）；,3,、易产生气溶胶或出现溅出的操作,如涂片、离心或其它操,作，应在,BSL-2实验室,的,级生物安全柜,中进行，并使用,个体防护,设备；,9,4,、尽可能,减少使用注射器针头,，实验中使用注射器时，用过,的针头,切勿,再,重新入套,或拔开注射器与针头，应直接放入,锐气收集器,，以免划破皮肤造成接种感染；,5、试验结束后，操作过程中所有可能与生物危险物接触或被,污染的实验器械或物品，能够高压的必须进行,高压消毒,；,6、实验中发生,意外污染,情况，应,立即报告,。,实验室安全操作,原则,10,实验室安全操作,-意外事故处理,1、实验过程中，如标本或含标本的前消化处理液被打翻，,污染操作台或地面，应以吸满,75乙醇,溶液的卫生纸覆,盖污染区，,15分钟,后卫生纸方可移去；,2、实验过程中，如污染物溅落到身体表面，或有割伤、刺,伤、烧伤、烫伤等情况发生，应,立即停止,实验并进行紧,急处理；更换被污染的工作服，皮肤表面用,消毒液,清,洗，伤口以,碘酒,及,酒精,消毒，眼睛用,无菌生理盐水,冲洗；,3、被污染的器械等立即浸泡于,含氯消毒剂,或,75乙醇,等溶,液中，实验完成后再进行,高压消毒,处理；,4、如果发生气溶胶污染或大面积污染，应,立即停止,实验并,关闭,实验室，对实验区域和实验室进行,紫外灯照射,消毒,2,小时以上,；对污染区域进行,空气熏蒸,消毒。,11,实验室安全操作-,绝对禁止,的处理方法,1、有可能造成污染面积扩大，如使用,75乙醇,或,甲酚皂液,擦洗,被污染的区域；,2、,直接用火焰,对未经任何处理的污染地面、操作台、器械,进行,烧灼,处理；,3、使用,消毒效果未经证实,的消毒剂进行消毒；,4、使用,低浓度的消毒剂,和,紫外灯,进行,短时间、长距离,照射,消毒。,12,实验室消毒与灭菌,1、物理消毒：,紫外线、高压灭菌,2、化学消毒：,乙醇、过氧乙酸、苯酚、含氯消毒剂,3、注意事项,13,物理消毒,紫外线,1、紫外线对结核杆菌有一定的杀灭作用，用辐射 强度在,100w/cm,2,以上的30W紫外线灯、相对湿度50%70%的,条件下，照射,40min,以上，对空气中结核杆菌的杀灭效,果可达99.9%以上；,2、在液层厚度3mm含菌107108cfu/ml的结核杆菌的菌悬,液，用10W紫外线灯在距离,0.5m,处持续照射,3分钟,，在,距离,1m,处持续照射,10分钟,后，菌悬液经培养无活菌生,长；,3、紫外线穿透力弱，,通常用于空气和物体表面消毒,，对空,气中细菌的杀灭更具优势，适合随时性空气消毒。,14,物理消毒,高压灭菌,1,、高压灭菌是对实验材料灭菌的,最有效,和,最可靠,的方法；,2,、通常下列组合可以确保正确装载的高压灭菌器 的灭菌效果：,121,、,15min/,115,、,25min,推荐,121,、,30min,。,15,化学消毒,乙醇,1,、结核杆菌（纯培养物）直接接触,70%-75%,乙醇,5-30,分钟,可被杀死，可用于,皮肤,消毒；,2,、但由于乙醇能,凝固蛋白,，使痰表面形成一层把菌,体包裹起来的膜，短时间内不能杀死细菌，通常,乙醇,不用于痰标本,的消毒。,16,化学消毒,过氧乙酸,1,、过氧乙酸气溶胶渗透性强、,易蒸发,，作用快,速，分解后不留有毒物质，适合于,空气消毒,；,2,、用,5g/L,过氧乙酸,水溶液经气溶胶喷雾器喷雾消,毒，喷雾量为,20,10ml/m,3,，密闭,60min,以上。,17,化学消毒苯酚,1、主要通过,破坏菌细胞膜,而致细胞质内容物漏,出，使菌体蛋白质变性、凝固，抑制菌体脱氢,酶和氧化酶等酶系统杀死结核杆菌；,2、2%苯酚,5分钟,、5%苯酚,1分钟,能杀死结核杆菌培,养物；,3、,5%苯酚,与痰液等量混合，,24小时,才能杀死结核,杆菌。,18,化学消毒含氯消毒剂,含氯消毒剂能使菌体的酶失活，还能与蛋白质,的氨基结合，使菌体蛋白氯化，代谢功能障碍，细,菌死亡。但对在,蛋白质混合液,中的结核杆菌,几乎无,消毒效果,。,19,化学消毒其它,1、结核杆菌较一般细菌对酸、碱抵抗力更强，可,在临床或动物标本中加入,4%NaOH，3%HCL,和,6%H,2,SO,4,，消化蛋白质及杀灭杂菌，以分离出结核杆菌；,2、结核杆菌对染料，如,113000孔雀绿,和,175000结晶紫,有抵抗力，通常在培养基内 加入一定量的孔雀绿或结晶紫抑制其他杂菌,生长。,20,注意事项,1、实验室含有生物危险物的临床标本及被污染的一次性用,品，实验完成后，应经,高压,消毒后方可,丢弃,或焚烧；,2、可重复使用的试验用品及器械，,高压,灭菌后再,清洗,使用；,3、试验用的,试管、吸管、注射器,，须装在,加盖,的容器内，经,高压,消毒后拿出实验室；,4、培养物或实验室垃圾，在丢弃前必须经过,高压,灭菌处理；,5、实验室内未经消毒的污水，,禁止,直接排入公共排水系统，,更不允许混入居民生活垃圾。,21,生物安全柜的使用,1,、正确安装，确保安全柜与外部排风系统压力平衡，保证安全柜处于,正常工作状态，,定期维护和检测，确保安全性；,2,、在开始工作前应考虑实验中的操作步骤和所需设备，充分,做好准备,工作；,3,、尽量,减少房间内人员走动,，保证正常气流；,4,、准备好,消毒剂,和处理遗洒事件的物品；,5,、前窗开至,适当高度,，打开安全柜的灯和风机；,22,生物安全柜的使用,6,、将,本次实验,所需物品放入生物安全柜内，并按照清洁物和污染物分别排列；,7,、,避免,物品挡住隔栅；,8,、将手,缓慢,放入生物安全柜，并等待,2-3min,，操作,时应在隔栅内侧靠近隔栅处操作；,9,、,避免,使用干扰安全柜内层流的实验手段（如离心,和使用明火等）；,23,生物安全柜的使用,10,、与污染物接触过的物品从生物安全柜中取出之前,必须经,表面去污处理,；,11,、所有的托盘或容器从安全柜中,取出前必须盖上,；,12,、用,75%,酒精,清洁安全柜所有内壁，清洁时安全柜,风机必须处于风机,工作状态,；,13,、工作结束后，安全柜继续开机,3-5min,；,14,、关闭,前窗、灯、风机,，打开,紫外灯,。,24,干净的物品,理想的工作台摆放原则（清洁,-,污染区）,在工作台面上的实验操作应该按照从,清洁区,到,污染区,的方向进行,被污染的区域,垃圾袋,废弃物托盘,生物安全柜的使用,25,二、菌株运输,26,法律依据,1、病原微生物实验室生物安全管理条例（国务院令第424号,2004.11.12）,2、可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输,管理规定（卫生部令第45 号 2005.12.28）,3、人间传染的病原微生物名录（卫生部 2006.1.11）,4、中国民用航空危险品运输管理规定（CCAR276）,5、危险物品航空安全运输技术细则（国际民航组织）,27,相关定义,1、,病原微生物,:是指能够使人或者动物致病的微生物。,2、,实验活动,:是指实验室从事与病原微生物菌（毒）,种、样本有关的研究、教学、检测、诊断等活动。,3、,可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或,样本,：是指在人间传染的病原微生物名录中,规定的第一类、第二类病原微生物菌（毒）种或,样本。,28,病原菌名称,危害程,度分类,实验活动所需生物安全实验室级别,运输包装分类,大量活,菌操作,动物感,染实验,样本,检测,非感染性材料的实验,A/B,UN,编号,结核分枝杆菌,第二类,BSL-3,ABSL-3,BSL-2,BSL-1,A,UN 2814,牛型分枝杆菌,第二类,BSL-3,ABSL-3,BSL-2,BSL-1,A,UN 2814,结核杆菌分类,人间传染的病原微生物名录,第二类：是指能够引起人类或者动物严重疾病，比较容易直接或者间接在,人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物。,样本检测：包括样本的病原菌分离纯化、,涂片,、显微观察、,培养、药物敏,感性实验,、生化鉴定、免疫学实验、PCR 核酸提取、等初步检,测活动。,29,县级将菌株或样本运输至州级,一、申请材料（原件一份，复印件三份）：,1、,可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运,输申请表.doc,；（,县级,）,2、容器或包装材料的批准文号、合格证书（复印件）或者,高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输容器或包装,材料承诺书;（,县级,）,3、申请方（,县级,）、接收方（,州级,）双方法人资格证明材,料（复印件）；,4、接收菌株或样本的单位(,州级,)同意接收的证明文件（,州,级自己拟定文件并加盖单位公章,）；,备注,：,接收单位（,州级,）具备从事高致病性病原微生物实,验活动资格的证明即要求接收单位（,州级,）,在,当地卫生局,进行,病原微生物实验活动备案,。,30,县级将菌株或样本运输至州级,二、运输有关规定：,1、在固定的申请单位（,县级,）和接收单位（,州级,）之间,多次,运输,相同,品种菌株种或样本的，可以申请多次运输。多次,运输的有效期为,6个月,；期满后需要继续运输的，应当重新,提出申请；,2、应当通过,陆路,运输；没有陆路通道，必须经水路运输的，,可以通过水路运输；紧急情况下或者需要将菌株或者样本,运往国外的，可以通过民用航空运输；,3、有关单位或者个人,不得,通过公共电（汽）车和城市铁路运,输菌株或样本。,31,县级将菌株或样本运输至州级,二、运输有关规定：,4、运输菌株或者样本，应当由,不少于人,的专人护,送，并采取相应的防护措施；,5、,承运单位,应当与,护送人,共同采取措施，确保所运,输的菌株或样本的安全，严防发生被盗、被抢、,丢失、泄漏事件。,32,县级将菌株或样本运输至州级,三、被盗、被抢、丢失、泄漏事的处理：,承运单位护送人,保藏机构,承运单位的主管部门护送人所在单位,保藏机构的主管部门,县级卫生主管部门或者兽医主管部门,公安机关,县人民政府,市级卫生主管部门或者兽医主管部门,省级卫生主管部门或者兽医主管部门,国务院卫生主管部门或者兽医主管部门,市人民政府,省、市、自治区人民政府,任何单位和个人,小时,小时,小时,小时,小时,小时,1,小时,33,菌株或样本运输包装要求,34,菌株或样本运输包装要求,35,菌株或样本运输包装主容器,36,菌株或样本运输包装次级容器,37,菌株或样本运输包装外包装,38,菌株或样本运输流程,39,三、风险评估,40,结核杆菌实验室实验活动,不同实验操作的实验室生物安全级别要求：,1、BSL-3实验室：根据名录的规定，在实验操,作涉及结核杆菌的大量培养（制备）、结核杆菌离心、冻干等易产生气溶胶的实验操作。,2、,BSL-2实验室,：临床样本的,结核杆菌分离培养,、,药物敏感性实验,、生化鉴定、免疫学实验、PCR核酸提取、,涂片,、显微观察等初步检测活动。,3、BSL-1实验室:对经有效方法灭活后不含结核杆菌,活菌材料的分子生物学、免疫学等实验。,41,实验活动中可能造成不良后果的因素与预防措施,1、实验样本的接收与开启,临床含结核菌样本在运输过程中可能会因容器盖子脱落或破碎使一些菌体产生气溶胶，扩散进入空气而造成污染。,预防措施,应采取防护措施，要求接收和打开样品要在,级生物安全柜内,打开，小心操作，避免产生,气溶胶,，操作人员要佩戴,N95口罩,，并准备好,消毒剂,。,42,实验活动中可能造成不良后果的因素与预防措施,2、结核杆菌培养（固体、液体培养）,在进行结核杆菌接种培养过程中，样本开封、转移、吸管吹吸、漩涡振荡混匀、离心等步骤均可产生气溶胶，在样本转移过程中培养物混合液的溅出、泼洒和容器的破碎等也可造成严重污染。,预防措施,（,1）在,级生物安全柜,工作台面应当放置一块,垫布,，避免,感染性物质的滴溅，使用后将其高压灭菌，操作过程,中最好使用,无菌的一次性吸管,；,（2）涡旋振荡、离心过程中应,拧紧,样本容器盖子，待,气溶,胶沉淀,后在,级生物安全柜,打开盖子；,（3）样本容器尽可能使用,塑料制品,，足够坚固，盖好盖子,后应无泄漏；,（4）样本接种后将其固定在架子上，尽可能,保持直立,。,43,实验活动中可能造成不良后果的因素与预防措施,3、结核杆菌药敏试验,在药敏试验中菌悬液制备时，需对培养物进行研磨，在使用玻璃研磨器时容器内会产生压力，含有感染性物质的气溶胶就可能逸出，玻璃容器可能破碎而释放感染性物质并伤害操作者。,预防措施,应采取防护措施，使用玻璃研磨器时应,戴手套,、,N95口罩,，操作和打开研磨器时应当在,级生物安全柜,内进行。,44,实验活动中可能造成不良后果的因素与预防措施,4、培养物与实验废弃物销毁,在待销毁培养物转移过程中培养物混合液溅出、泼洒和容器的破碎等可造成严重污染；实验室内实验废弃物容器外表可能污染病原微生物，未经消毒转移造成污染；用于销毁的培养物与实验废弃物，置入高压灭菌器，如装得过满或过于密闭，可能造成灭菌不彻底，将未灭活的培养物与实验废弃物送出室外，对人与环境造成极大威胁。,预防措施,（1）传代菌种或培养物销毁应有,销毁程序,及相应,原始记录,，所有,菌种或培养物灭活或销毁时应均有,2人以上,共同执行，销毁记,录应包括,销毁方式,、,销毁物品明细,、,灭菌温度与时间,。,（2）在生物安全柜内产生的所有废弃物，出生物安全柜前需用,消,毒液擦拭消毒,后拿出生物安全柜，然后放入高压灭菌器中，,经高压灭菌,（121、30min）,后集中处理。,45,实验活动中可能造成不良后果的因素与预防措施,5、室内空气、实验用品以及操作台面污染,实验操作中释放的较大微生物粒子和液滴（直径大于5m）会迅速沉降到工作台面和操作者的手上，对感染性材料的清除污染和处理可能导致手污染，造成感染性物质的食入或与皮肤和眼睛的接触导致感染；,这些含菌液滴可沉降附着实验室设备、仪器、工作服、体表等表面，被污染这些表面可作为传播媒介，成为实验室感染的主要途径，所以严格消毒是预防和控制结核分枝杆菌医源性和实验室感染的重要措施。,预防措施,（1）空气消毒,结核分枝杆菌气溶胶是有效的传播途径，每次实验结束后应保持,中央空调系统,运行,2个小时,，再采用,紫外线,照射,1小时,。,46,实验活动中可能造成不良后果的因素与预防措施,预防措施,（2）结核分枝杆菌,污染物与台面的消毒,可采用,5000mg/L含氯消毒液,或,75%酒精,对污染物、实验室桌,面及地面进行消毒，所有废弃物均应高压灭菌后送出实验室。,（3）结核分枝杆菌,污染的皮肤消毒,手及其他部位的皮肤被污染应随时进行消毒，可用,75%酒精,、,无水洗手液,对皮肤进行擦拭消毒。,（4）结核分枝杆菌,污染的防护用品消毒,可用,75%酒精,对防护用品表面（眼罩、手套等）擦拭消毒。,（5）,实验记录的消毒,当日实验结束后,原始记录数据通过,传真,或,扫描,方式传出，,并按顺序将原始记录平铺于工作台，开,紫外线灯,照射,1小时以上,。,47,谢谢 ！,48,