现代生物学方法论课件

现代生物学方法论,核酸技术,核酸技术-用来研究核酸（DNA和RNA）的技术,纯化,定量,重量上的丰度：光谱定量,数量上的绝对丰度：定量PCR,高通量相对丰度：DNA芯片,高通量绝对丰度：序列分析基因表达（SAGE）,分子量大小：凝胶电泳,合成,从头合成：寡聚核苷酸的合成,基因扩增：PCR反应,概述,其他核酸技术,测序,基因的表达与克隆,印记杂交（Southern与Northern）,生物芯片,荧光原位杂交,启动子技术,SELEX技术,反义技术,RNAi技术,非编码RNA,核酸的生物信息学,概述,一、反义技术,反义技术的概念,反义技术的分子机制,反义核酸的设计及注意事项,核酶,脱氧核酶,1.1 反义技术概述（antisense technology),反义技术是根据核酸杂交原理特异性抑制特定基因,(mRNA)表达的一种生物技术，包括反义RNA、反义,DNA、核酶以及脱氧核酶。,1.1.1概念,1.1.2 反义技术的主要应用方向：,1 通过抑制基因表达活性研究特定基因在生理、病理条件,下的生物学功能。,2 研究和开发以疾病相关基因为靶的反义药物,反义药物-利用反义技术研制的药物，以特异的基因为靶，,并与之特异性互补结合的一段约20个核苷酸组成的人工合成,的寡核苷酸。,1998年FDA批准了第一个反义药物Vitravene,(巨细胞病毒性视网膜炎）,1.2 反义技术分子机制的模型,1）仅由结合介导的机制,反义核酸与特定的序列结合，从而抑制该RNA与蛋白、,其他核酸或其他因子的相互作用，最终影响RNA的,代谢与功能。,2） 结合激活不稳定的机制。,通过反义结合，影响RNA的稳定性、RNA加工、亚细胞定位,和转运等。,3） 其他机制,1.2.1 机制,1.2.2 影响反义核酸生物学活性的因素：,反义核酸浓度,靶,RNA,浓度,靶,RNA,代谢速率,抑制机制的类型和效率等,1.2.3 反义技术需要注意的问题,反义核酸的纯度,反义核酸的结构,靶,RNA,结构,反义核酸在组织和细胞内的转运和分布,反义核酸与非核酸因子的结合及其影响,不同抑制机制的作用,1.2.4能够有效起抑制作用的反义核苷酸特性：,DNA,序列的特异性和唯一性,导入细胞的高效性,无非特异性结合蛋白,反义寡核苷酸,mRNA,特异形成杂交体,靶蛋白或靶,mRNA,水平下降,反义寡核苷酸无毒性,反义寡核苷酸不引起炎症反应或免疫反应,1 靶目标的选择尽量避免易突变区,一般选择目标为起始密码子（AUG )或其附近的,15-25个碱基序列，以及该靶mRNA的5帽区，,3非翻译区,2 长度,反义核苷酸一般是15-20bp长的单链，但是设计病毒,和质粒载体可用较长的或全长DNA序列。,3 反义核苷酸的修饰,4 缺陷的避免,避免回文结构以形成二聚体，,GC含量不能太高避免产生高毒性和非特异性，GC,含量高的序列可用硫代磷酸型寡聚体。,1.3 反义核苷酸设计原则：,1.4 核酶,（Ribozyme,catalytic RNA, RNA enzyme、RNAzyme）,具有催化活性的RNA分子,1.4.1核酶的发现,1981年,Cech发现四膜虫前体rRNA可以在没有蛋白质,存在的情况下自身催化切除内含子，完成加,工过程。,1983年,Altman在研究RNaseP时发现，该酶中的RNA,分子单独完成前体tRNA加工。,1989年,Cech与Altman共同获得了诺贝尔化学奖,剪切型核酶,剪接型核酶,根据催化反应,锤头核酶,发夹核酶,丁型肝炎病毒（HDV)核酶,RNaseP,组II,内含子,组I,内含子,1.4.2 核酶的分类,自身剪切类核酶：,在自然界发现的自身剪切类核酶有锤头核酶、,发夹核酶、肝炎,病毒（HDV)核酶、VS核酶、glmS核酶,和CPEB3核酶。,自身剪切类核酶共同特征：,1 分子小，一般为35-155个核苷酸。,2 剪切自身或异体RNA序列中的保守位点的磷酸二酯键，,相当于内切核酸酶，产物带有5-OH和2，3-环状膦酸酯。,3 催化机制都是一般酸碱催化，质子的转移是共同的。,4 属于金属酶，催化反应都需要二价金属离子。,锤头核酶：,小分子自身分裂RNA，自身分裂是顺式（cis)反应，分子间分裂是反式（trans)反应。,箭头指向切割位点,最小锤头核酶由三个结构域组成：,1 分裂结构域GUX（X可以是A、U、C但不可以为G）,2 催化结构域：其中有13个核苷酸是保守的,2 底物结合结构域,二价金属阳离子（种类、离子强度）,温度,pH,值,影响,锤头核酶,活性的主要因素,自身剪接类核酶：,I类内含子、II类内含子、类-I类内含子（groupI,like-intron)-GIR1分支核酶和剪接体，以及具有3，,5-RNA连接酶活性的天然核酶,I类内含子的特征：,长度,140-4200nt,，剪接位点序列为,5UG3,催化核心是保守的,有内部的引导序列（,IGS,）,通过转酯反应实现自身的剪接，需要辅因子,II类内含子特征,：,最大的核酶之一，长度为,400-1000nt,。,II,类内含子不富含高度保守的序列（结构域,V,和结,构域,IV,可读框除外），但是采用高度保守的二级结,构，,6,个结构域围绕大的中心接合以特定的位置排列。,RNP类核酶,核糖核蛋白酶（ribonucleoprotein enzyme, RNPzyme)，,由RNA和蛋白质成分组成的酶。,分类：,根据RNP酶中RNA和蛋白质分子对起结构与功能的贡献,是不同。,1 RNP核酶：由一个催化RNA和多个蛋白质组成，,RNase P、剪接体和核糖体等。,2 RNP酶：催化作用依赖于蛋白质和RNA的密切合作，端粒酶。,3 RNP蛋白质酶：由结构RNA和蛋白质酶组成，信号识别颗粒SRP。,核酶的应用,核酶在抗,HIV,中的应用,核酶抗肝炎病毒的应用,核酶在抗生殖道感染的应用,核酶在抗白血病中的应用,核酶在抗移植排斥反应中的应用,1.5 脱氧核酶,（Deoxyribozyme,catalytic DNA, DNA enzyme、DNAzyme）,单链,DNA,和单链,RNA,的区别,1 RNA,中有,2-OH,，,DNA,则没有,2 RNA,中有尿嘧啶（,U),，,DNA,则是,5-,甲基尿嘧啶（,T),3,糖环的折叠上，,RNA,的优势构象是,C,3,-endo,，而,DNA,的优势构象是,C,2,-endo,。,1994,年,Breaker R R,与,Joyce G F,通过体外筛选得到具有催化活性的,DNA,Breaker R R,Joyce G F,与核酶相比，脱氧核酶具有明显的优势：,1 相对分子质量小，合成成本低，稳定性高，选择性强，,不仅可以精确的切割或连接底物RNA/DNA，而且可以,催化更广泛的化学反应。,2 脱氧核酶具有与一般药物相似的动力学特点，作用程序,和时间容易控制。,脱氧核酶可以催化反应类型,切割,RNA,的脱氧核酶,切割,DNA,的脱氧核酶,聚核苷酸激酶活性的脱氧核酶,连接酶活性的脱氧核酶,催化卟啉环金属螯合反应,的,脱氧核酶,N-,糖基化激酶活性,的脱氧核酶,常见的几种脱氧核酶,10,23,结构脱氧核酶,8,17,结构脱氧核酶,手枪型脱氧核酶,二分结构脱氧核酶,R=A or G,Y=C or U,substrate,Cleavage site,10,23,结构脱氧核酶,1 在模拟的生理条件（2mmol/LMgCl2、150mmol/LKCl、,pH7.5、37），以多转化率分裂靶RNA。,2 选择靶位点灵活，能够用任一靶RNA形成Watson-Crick碱基,配对，能够在任一嘌呤和嘧啶之间分裂RNA。,影响,10,23,脱氧核酶,活性的主要因素,活性中心核苷酸的组成,二价金属阳离子（种类、离子强度）,反义臂长度与核苷酸组成,效应物分子的作用,8,17,结构脱氧核酶,1 原型酶只分裂底物5-AG-3，A不与脱氧核苷,酸配对,2 靶部位的下游有“rG-dT”摆动配对。,脱氧核酶的应用,脱氧核酶在基因治疗中的应用,在抗肿瘤方面应用,抗,HIV,病毒方面应用,其它针对,mRNA,的应用,在,PCR,技术上的应用,作为分子生物学分析的工具,根据酶活性部位柔性的基本理论，考虑RNA柔性比DNA大，设计一个以锤头核酶为催化结构域和以DNA为骨架的环状RNA-DNA酶。,Hammerhead ribozyme,DNA,20 mer,随机DNA,体外筛选,5轮筛选,5-ACA TGG CTA CCC AAG CAT GA-3,cRD,E,Scheme for construction of circular RNA-DNA enzyme,环状核酶的构建,锤头核酶,单链DNA,10-23结构脱氧核酶,单链DNA载体M13mp18,5-ACA TGG CTA CCC AAG CAT GA-3,cRD,E,环状RNA-DNA酶,可复制 的环状DNAzyme,C-D,Z482,以高活性、结构稳定的10-23 DNAzyme为催化中心，以单链载体M13mp18为骨架构建了环状可复制的10-23 DNAzyme,。,环状脱氧核酶的构建,以10-23 DNAzyme-hammerhead ribozyme 为催化中心，以单链载体pBlue script II KS (+)为骨架构建了复合酶DNAzyme-RNAzyme。,单链DNA载体M13mp18,10-23结构脱氧核酶,编码锤头核酶DNA,10-23结构脱氧核酶,单链DNA载体pBluescript II KS(+),Hammerhead,ribozyme activity,DNAzyme-RNAzyme,锤头核酶,单链DNA,cRD,E,10-23 DNAzyme activity,Transcription,in vitro,“Translation”,Replication,pepzyme activity,Circular DNAzymes,环状脱氧核酶-核酶复合酶的构建,核酶与脱氧核酶的转换,核酶与脱氧核酶的转换,conversion,双功能脱氧核酶的设计与构建,二 RNA干涉,(RNA interference,RNAi),2.1 RNA 干涉现象的发现,1990,年，为加深矮牵牛花,(petunias),的紫色，,Jorgensen,等导入了一个强启动子控制的色素基因,.,可是结果与预期相反，许多花瓣颜色并未加深，反而呈杂色甚至白色,.,这是由于转基因和同源的内源基因的表达都被抑制了，,Jorgensen,把这个现象命名为共抑制,(,cosuppression,),。,1995,年，康奈尔大学的,Su,Guo,在用反义,RNA(antisense,RNA),阻断线虫基因表达的试验中发现， 反义,RNA(antisense,RNA),和正义,RNA(sense,RNA),都阻断了基,因的表达。,1998,年，,Andrew Fire,等的研究证明，在正义,RNA,阻断,了基因表达的试验中，真正起作用的是双链,RNA,，同时包,含了正义链和反义链的双链,RNA (double-stranded RNA,，,dsRNA,),阻断基因表达的效果要比单独注射正义链或者反义,链强得多。,1998 年2 月19 日 自然杂志(Nature),Fire 与 Mello 发现RNAi 的实验,带有肌肉蛋白编码信息的RNA 被注射到线虫(C. elegans),体内. 单链RNA 没有产生任何效果. 但当双链RNA 注射之,后，线虫开始抽搐，这是一种类似于携带有肌肉蛋白缺陷,型基因的线虫所表现出的表型。,2006 年诺贝尔生理学或医学奖,Andrew Z. Fire,Craig C. Mello,颁奖声明,获得者发现了一种可以针对特定基因降解其mRNA 的方式，在这种RNA 干涉现象中， 双链RNA(double-stranded RNA) 以一种非常明确的方式抑制了基因表达。植物、动物、人类都存在RNA 干涉现象，RNA 干涉对于基因表达的调控、对病毒感染的防护、控制跳跃基因具有重要的意义。,dsRNA的分子调控分类,mRNA,降解,转录抑制,翻译抑制,染色体重构,2.2 RNAi的分子机制,RNAi的分子机制,RNAi的分子机制,2.2.1 dsRNA的产生,dsRNA 来源：,细胞内源性基因的双向表达,具有反向重复结构的细胞内源性基因表达形成的发夹状,RNA,（,shRNA,),转基因表达的,mRNA,异常聚合,转座子转录,RNA,病毒基因组或病毒感染复制过程中的中间,RNA,产物,实验方法通过质粒载体或病毒载体转染表达的,dsRNA,或,shRNA,2.2.2 起始阶段：dsRNA被Dicer 酶加工成为 siRNA,Dicer 酶（RnaseIII 核糖核酸酶家族）,能够在RNAi中能够有效将dsRNA降解为siRNA，进而诱导RNAi,Dicer 酶在进化上高度保守,Dicer酶以单体形式催化两个核酸内切反应,2.2.3 中间阶段：RISC装载siRNA,2.2.3.1 RNA诱导的沉默复合体,RISC，RNA-induced silencing complex,2.2.3.2 RISC的装载与起始阶段偶联,2.2.3.3 RISC装载单链siRNA,如果双链的其中一端不稳定，那么这一段具有5磷酸基团的单链,更加倾向于与RISC进行装配，那么这条链会引导RISC寻找与之,匹配的mRNA并进行切割，此条链称为引导链（guide strand)，,另一条链称为过客链（passenger strand)，会被遗弃不用。,影响siRNA链选择的两个因素：,siRNA热力学稳定性；Dicer酶剪切方向,2.2.3.4 RISC装载对ATP的依赖,精简的RISC不需要ATP，完整的RISC需要ATP,2.2.4 完成阶段：RISC剪切mRNA,处于活性状态的RISC装载有siRNA的引导链，接下来,它将寻找识别与之匹配的mRNA，一旦mRNA与引导链,之间有着充分的碱基互补配对，RISC将会对mRNA进,行切割，这一过程与 siRNA 过客链的剪切过程类似,剪切位点的选择,高度特异，通常位于从siRNA5端数起的11到12个碱基位置,2.3 siRNA分子靶位点的选择,靶基因中RNA干涉作用位点的选择遵循原则：,1）从起始密码子寻找5-AA（N19）TT序列，如果在靶基因中不存在这种序列，,可以寻找5-AA(N21)或5-NA（N21)序列。,2）如果需要抑制内源性靶基因的表达以后在表达该基因的突变体或含有标,签的融合基因，则靶位点应该选择基因的5或3非编区，以便于后续的实验操作,3）避开靶基因的内含子序列，因为RNAi主要发生在胞浆内，而未拼接的mRNA,主要位于细胞核内,4）选择GC含量比较低的序列作为 siRNA。一般来说，G/C含量为,40-55%之间的siRNA比G/C含量大于55%的siRNA更有效，此外富,含G序列更容易在细胞中形成高级结构导致非特异性的反应,5）设计时最好找寻形成二级结构趋势较小的位点,6）在进行RNA干涉实验室，针对每个靶基因至少要设计并分析4个,siRNA分子并尽可能使这些siRNA位点沿着靶基因分布，一寻找有效,的靶位点，提高实验的成功率,7）确定靶位点后，应该通过BLAST检索确保选择的siRNA与其它基,因没有明显的同源性,2.3 siRNA分子靶位点的选择,化学合成siRNA,靶mRNA序列：5-aa,guaucgaguucagcauucc,uu-3,siRNA分子： 5-,guaucgaguucagcauucc,uu-3 正义链,3-uu,cauagcucaagucguaagg,-5 反义链,siRNA分子的设计,合成时，可以用T代替U降低成本，提高siRNA分子的稳定性。,体外转录合成siRNA,成本低，抑制效果明显优于化学合成,实验室通常采用T7RNA聚合酶体外转录合成siRNA,采用RNA聚合酶III启动子表达 siRNA分子,载体表达法,PCR,方法,采用RNAseIII制备siRNA分子,首先在体外以长为,200-1000bp,的,cDNA,为模板转录合成正义与反义,的单链,RNA,分子，,然后通过退火形成长的,ds,分子，再用,Dicer,核酸酶进行切割得到,siRNA,分子的混合物，通过纯化取出没有被切割的双链,RNA,分子,和,DNA,模板，,siRNA,分子可以用于转染细胞。,优点：不需要大量的合成并筛选有效的siRNA作用位点,缺点：可能会产生非特异性的基因沉默,RNAi实验注意事项：,1 必须采取措施防止和消除RNase的污染。,2 在进行RNA干涉实验之前，应该考虑到靶基因产物的,半衰期及其在细胞中的丰度和表达调控机制。RNAi不,适合研究具有长半衰期的蛋白质在细胞中的功能。,3 RNAi不适合有些酶基因的功能研究。,4 用于转染细胞的siRNA分子的浓度同靶基因的特性,和细胞类型有关。用于转染细胞的siRNA分子的浓度,一般在30-100nmol/L之间。,5 不同细胞的转染效率是不同的，对于不同的转染试剂,和培养细胞需要通过预实验来确定转染条件。生长状况,良好的细胞转染效率要比生长状况较差的细胞要高。,6 尽量采用传代次数较少的，一般采用传代次数在,50代以内的细胞进行转染。,7 细胞密度对转染效率的影响，对贴壁细胞来说，最佳转染密,度为30-70%。,8 用适当的阳性siRNA对照优化转染和检测条件。看家,基因是较合适的阳性对照。要有1-2个阴性对照来确定,靶siRNA对靶基因抑制作用的特异性。,9 抑制靶基因后，先观察细胞表型的变化，然后通过,免疫印迹与免疫荧光检测细胞内的蛋白质水平的变化。,若没有特异的靶蛋白抗体，可以通过Northern印迹确定,mRNA水平的变化。,10 体外合成的siRNA对靶基因的抑制作用是瞬时的，细胞,中受到抑制的蛋白一般在转染5-7天后，即经过7-10个细胞,增殖周期就可以逐渐恢复至正常水平。,11 siRNA不能抑制靶基因表达时，首先要查明所采用的,基因序列和试验用的细胞系是否来源于同一物种，然后,检查所采用的基因序列是否可靠。,启动子技术,启动子与基因表达调控,启动子的预测技术,转录活性的测定,非编码RNA,非编码,RNA,的概念与种类,非编码,RNA,的功能,非编码,RNA,的预测与鉴定,研究非编码,RNA,的功能的方法,非编码,RNA,技术应用的实例,microRNA,miRNA,的分离与发现,miRNA,的特征与功能,miRNA,的调控机制,miRNA,靶位点预测,miRNA,应用的实例,SELEX技术-指数级富集的配体系统进化技术,（,Systematic Evolution of Ligands by Exponetial Enrichment,),SELEX,技术简介（概念、特点、原理）,单链,DNA,文库的,SELEX,筛选,单链,DNA,文库的,SELEX,筛选,核酸的生物信息学,1 核酸序列数据库,三大核酸序列数据库介绍,三大核酸序列数据库基本结构,核酸序列数据库检索方法,2,核酸序列的分析,Blast,的使用方法,核酸序列的双重比对,一 核酸序列数据库,核酸的生物信息学,二 核酸的二级结构预测与核酸的网上资源,1 核酸的二级结构预测,方法简介,常用软件及使用方法,2,核酸的网上资源,综合网站介绍,不同领域相关网站,综述：,1 RNAi,2 非编码RNA,3 合成生物学,