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,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,目 录,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,目 录,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,目 录,目 录,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第 十 章,三羧酸循环,Tricarboxylic Acid Cycle,1,第 一 节 三羧酸循环的发现,Dis,covery of the Citric Acid Cycle,2,糖原,三酯酰甘油,蛋白质,葡萄糖,脂酸,+,甘油,氨基酸,乙酰,CoA,TCA,循环,2H,呼吸链,H,2,O,ADP+Pi,ATP,CO,2,*,营养物在生物体内氧化的一般过程,一、三羧酸循环是三类营养物质氧化分解的（共同）第二阶段,3,在真核生物，,TCA,循环在,线粒体,中进行，与呼吸链在功能和结构上相偶联。,4,三羧酸循环,亦称柠檬酸循环（,citric acid cycle,），这是因为循环反应中的第一个中间产物是一个含三个羧基的柠檬酸。由于,Krebs,正式提出了三羧酸循环的学说，故此循环又称为,Krebs,循环。,二、,Krebs,发现三羧酸循环,5,1937,年，,Hans Krebs,利用鸽子胸肌（这块肌肉在飞行中有相当高的呼吸频率，因此特别适合于氧化过程的研究）的组织悬液，测定了在不同的有机酸作用下，丙酮酸氧化过程中的耗氧率，,首次提出在动物组织中丙酮酸氧化途径的假说,。,6,Albert Szent-Gyorgyi,等已经发现动物肌肉组织中某些,4,碳二羧酸（,琥珀酸、延胡索酸、苹果酸和草酰乙酸,）能刺激氧的消耗。,Krebs,证实了这项发现，并且发现它们也可刺激,丙酮酸,的氧化过程。而且他还发现肌肉中丙酮酸的氧化还可被,6,碳三羧酸，如,柠檬酸、顺乌头酸和异柠檬酸,及,5,碳的,-,酮戊二酸,激活。上述有机酸的激活效应是显著的，任何一种这些有机酸的增加，甚至是很少量的增加都能大大激活丙酮酸的氧化过程。,7,Krebs,的第二项重大发现是观察到丙二酸对丙酮酸有氧氧化的抑制作用。,丙二酸是琥珀酸的类似物，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，在肌肉悬浮液中，无论加入上述哪一种有机酸，只要丙二酸存在，丙酮酸的有氧氧化过程就会被抑制。,这表明在涉及丙酮酸氧化的酶促反应中，琥珀酸和琥珀酸脱氢酶必定是很关键的成分。,Krebs,进一步发现，当用丙二酸去抑制肌肉组织悬液中的丙酮酸的有氧氧化时，在这个悬液介质中就会有柠檬酸、,-,酮戊二酸和琥珀酸的积累，,这表明柠檬酸和,-,酮戊二酸通常为琥珀酸的前体。,8,根据上述实验观察和一些其他的证据，,Krebs,得出一个结论：上述有机三羧酸和二羧酸可以以一个符合化学逻辑的序列排列。因为用丙酮酸和草酰乙酸与肌组织共同孵育，即可导致溶液介质中柠檬酸的堆积，所以,Krebs,推理这一系列反应是以循环的方式而不是以线性的方式存在，即它的开始和结尾是连在一起的。,9,从这些简单的实验和逻辑推理中，,Krebs,假定他所称的柠檬酸循环是肌肉中碳水化合物氧化的主要途径。柠檬酸循环也称,TCA,循环，因为在,Krebs,提出这个循环假说的若干年以后，还不确定柠檬酸或者一些其它的三羧酸，例如异柠檬酸是否是由丙酮酸和草酰乙酸反应所形成的第一个产物。自,Krebs,提出,TCA,循环的假设后，研究发现该循环不仅在肌肉组织中起作用，而且在需氧动物和植物的所有组织中，以及许多需氧微生物中均发挥着功能。,10,TCA,循环最初只是建立在实验基础上的假说。随后，在体外对参与循环中酶的研究证实并阐明了该循环的细节。但是这些酶是否在完整的活细胞的循环中真正发挥功能？细胞内该循环的效率是否足以解释动物组织中葡萄糖氧化的效率？这些问题已经通过用同位素标记的代谢物研究（如丙酮酸或乙酸酯分子中特定碳原子的,13,C,或,14,C,标记等同位素示踪实验），证实,TCA,循环确实以很高的效率在活细胞中存在。现在,TCA,循环已被公认为是营养物分解代谢的必经途径。,11,第 二 节三羧酸循环的反应过程,Reactions of Tricarboxylic Acid Cycle Reactions,12,TCA,循环是一个由一系列酶促反应构成的循环反应系统，在该反应过程中，首先由,乙酰,CoA,（主要来自于三大营养物质的分解代谢）与,草酰乙酸,缩合生成含,3,个羧基的,柠檬酸,（,citric acid,），再经过,4,次脱氢、,2,次脱羧，生成,4,分子还原当量（,reducing equivalent,）和,2,分子,CO,2,，重新生成,草酰乙酸,的这一循环反应过程称为,三羧酸循环,。,13,还原当量（,reducing equivalent,）,一般是指以氢原子或氢离子形式存在的一个电子或一个电子当量。,14,一、,TCA,循环由八步反应组成循环反应途径,15,（一）乙酰,CoA,与草酰乙酸缩合成柠檬酸,乙酰辅酶,A,（,acetyl CoA,）与草酰乙酸（,oxaloacetate,）缩合成柠檬酸（,citrate,）；,反应由,柠檬酸合酶（,citrate synthase,）,催化。,16,（二）柠檬酸经顺乌头酸转变为异柠檬酸,此反应是由,顺乌头酸酶,催化的异构化反应。,由两步反应构成，,(1),脱水反应；,(2),水合反应。,17,（三）异柠檬酸氧化脱羧转变为,-,酮戊二酸,异柠檬酸在,异柠檬酸脱氢酶,（,Isocitrate dehydrogenase,）作用下，氧化脱羧而转变成,-,酮戊二酸（ ,- Ketoglutarate,）。,18,（四）,-,酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰,CoA,在,-,酮戊二酸脱氢酶复合体,催化下,-,酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰,CoA(succinyl-CoA),；,该脱氢酶复合体的组成及催化机制与丙酮酸脱氢酶复合体类似。,19,（五）琥珀酰,CoA,合成酶催化底物水平磷酸化反应,在,琥珀酰,CoA,合成酶,催化下，琥珀酰,CoA,的高能硫酯键水解与,GDP,磷酸化偶联，生成琥珀酸、,GTP,和辅酶,A,。,这是三羧酸循环中唯一直接生成高能磷酸键的反应。,20,GTP,GDP,ATP,ADP,核苷二磷酸激酶,目 录,21,（六）琥珀酸脱氢生成延胡索酸,此步反应由,琥珀酸脱氢酶,催化，其辅酶是,FAD,，是三羧酸循环中唯一与内膜结合的酶。,22,（七）延胡索酸加水生成苹果酸,延胡索酸酶,催化此步反应,23,（八） 苹果酸脱氢生成草酰乙酸,苹果酸脱氢酶,催化此步反应，辅酶是,NAD,+,。,目 录,24,CoASH,NADH+H,+,NAD,+,CO,2,NAD,+,NADH+H,+,CO,2,GTP,GDP+Pi,FAD,FADH,2,NADH+H,+,NAD,+,H,2,O,H,2,O,H,2,O,CoASH,CoASH,H,2,O,柠檬酸合酶,顺乌头酸酶,异柠檬酸脱氢酶,-,酮戊二酸脱氢酶复合体,琥珀酰,CoA,合成酶,琥珀酸脱氢酶,延胡索酸酶,苹果酸脱氢酶,GTP,GDP,ATP,ADP,核苷二磷酸激酶,目 录,25,2CO,2,4,2H,26,二、一次,TCA,循环生成,2,分子,CO,2,在,TCA,循环反应过程中，从,2,个碳原子的乙酰,CoA,与,4,个碳原子的草酰乙酸缩合成,6,个碳原子的柠檬酸开始， 反复地脱氢氧化。,TCA,循环中通过脱羧方式生成,CO,2,。,1,个二碳单位进入,TCA,后，有,2,次脱羧反应，生成,2,分子,CO,2,，这是体内,CO,2,的主要来源。,TCA,循环过程中，共有,4,次脱氢，其中,3,次脱氢由,NAD,+,接受，,1,次由,FAD,接受。,27,TCA,循环过程中，共有,4,次脱氢，其中,3,次脱氢由,NAD,+,接受，,1,次由,FAD,接受。,TCA,循环本身每循环一次只能以底物水平磷酸化生成,1,个,ATP,。,TCA,循环总反应式：,CH,3,COSCoA + 3NAD,+,+FAD + GDP + Pi + 2H,2,O,2CO,2,+ 3NADH + 3H,+,+ FADH,2,+ HSCoA + GTP,28,三、,TCA,循环的中间产物本身并无量的变化,TCA,循环的中间产物包括草酰乙酸在内起着催化剂的作用，本身并无量的变化。,不可能通过,TCA,直接从乙酰,CoA,合成草酰乙酸或其他中间产物；同样，这些中间产物也不可能直接在,TCA,循环中被氧化生成,CO,2,和,H,2,O,。,TCA,循环中的草酰乙酸主要来自丙酮酸的直接羧化，也可通过苹果酸脱氢产生。无论何种来源，其最终来源是葡萄糖。,29,第 三 节三羧酸循环的调控,Regulation of Tricarboxylic Acid Cycle,30,一、丙酮酸脱氢酶复合体的活性变化可影响乙酰,CoA,的生成,别构调节,当脂肪酸或乙酰,CoA,充足时，或,ATP/ADP,和,NADH/NAD_,比值增高时，该酶活性被别构抑制；,而当机体需要能量时，或,ATP/ADP,降低时，该酶被,AMP,等变构激活。,化学修饰调节,当胞内,ATP,增高时，丙酮酸脱氢酶复合体成分中的丙酮酸脱氢酶（,E1,）由于磷酸化而失活；,当,ATP,减少时，磷蛋白磷酸酶去除,E1,上的磷酸基团而激活该复合体。,31,二、,TCA,循环受底物、产物和调节酶活性调节,TCA,循环的速度和流量主要受种因素的调控：,底物的供应量,催化循环最初几步反应的酶的反馈别构抑制,产物堆积的抑制作用,32,（一）,TCA,循环中有个调节调节酶,TCA,循环中催化个不可逆反应的酶：,柠檬酸合酶,异柠檬酸脱氢酶,-,酮戊二酸脱氢酶,33,乙酰,CoA,柠檬酸,草酰乙酸,琥珀酰,CoA,-,酮戊二酸,异柠檬酸,苹果酸,NADH,FADH,2,GTP,ATP,异柠檬酸,脱氢酶,柠檬酸合酶,-,酮戊二酸,脱氢酶复合体,ATP,+,ADP,ADP,+,ATP,柠檬酸,琥珀酰,CoA,NADH,琥珀酰,CoA,NADH,+,Ca,2+,Ca,2+, ATP,、,ADP,的影响,产物堆积引起抑制,循环中后续反应中间产物别位反馈抑制前面反应中的酶,其他，如,Ca,2+,可激活许多酶,三羧酸循环的调节,34,（二）,TCA,循环与上游和下游反应协调,在正常情况下，（糖）酵解途径和,TCA,循环的速度相协调；,氧化磷酸化的速率对,TCA,循环的运转也起着非常重要的作用。,35,三、,TCA,循环的多种酶以复合体形式存在于线粒体,TCA,循环中的酶在线粒体中是以多种酶组成的复合体形式存在，这种酶复合体被称为代谢区室（,metabolons,），它在细胞内能够有效地将代谢中间产物从一种酶传递给另一种酶。这些复合体具有高效介导中间产物流通的功能，因此也可影响代谢的速率。,36,第四节三羧酸循环的生理意义,Physiologic Significance of Tricarboxylic Acid Cycle,37,一、,TCA,循环是一条,“,两用代谢途径,”,TCA,循环在大多数生物中是分解代谢途径,;,多种生物合成途径也利用,TCA,循环的中间产物作为合成反应的起始物。,（一）,TCA,循环参与合成和分解途径的组成,38,TCA,中间产物,（二）,TCA,循环中间产物是合成糖、脂肪酸和氨基酸的前体,1. TCA,循环中间产物可以异生为糖,草酰乙酸,异生为葡萄糖,氨基酸,39,乙酰,CoA,2. TCA,循环中间产物可为脂酸合成提供原料,合成脂酸,柠檬酸,-,丙酮酸循环,40,-,酮戊二酸,+ NH,4,+,3. TCA,循环中间产物可为非必需氨基酸合成提供碳架,谷氨酸,谷氨酸脱氢酶,NADH + H,+,NAD,+,41,42,（三）添补反应补充,TCA,循环中间产物,参与其他代谢途径而消耗的,TCA,循环中间产物必须及时补充，才能保持,TCA,循环顺利进行。这类反应被称为,添补反应（,anaplerotic reaction,）,。,最重要的添补反应是由丙酮酸羧化酶催化的，从丙酮酸生成草酰乙酸的反应。,丙酮酸,+ CO,2,草酰乙酸,丙酮酸羧化酶,ATP,ADP + Pi,43,乙酰,CoA,是丙酮酸羧化酶的激活剂；,TCA,循环中的酶促反应可以将草酰乙酸转变为其他中间产物；,此外，可由别的途径生成一些中间产物，如：,奇数碳链脂肪酸,琥珀酰,CoA,某些氨基酸,-,酮戊二酸、草酰乙酸,44,二、,TCA,循环在三大营养物质代谢中具有重要生理意义,（一）,TCA,循环是三大营养物质的最终代谢通路,（二）,TCA,循环是糖、脂肪和氨基酸代谢联系的枢纽,45,第五节三羧酸循环关键反应的分析原理,Analytical Principles of Key Reactions of Tricarboxylic Acid Cycle,46,一、采用分光光度法测定硫氢辅酶,A,生成量分析柠檬酸合酶活性,反应生成的辅酶,A,和,5,5-,二硫代双（,2-,硝基苯甲酸）（,DNTB,）在,pH 7.4,、,0.1 M,三乙醇胺和,0.2 M,乙二胺四乙酸钙钠（,EDTA,）溶液中反应生成硫氢辅酶,A,，其在,412 nm,时有吸收峰，通过分光光度计测定吸光度，测定硫氢辅酶,A,的生成量。以此反映柠檬酸合酶酶活性。,47,二、采用分光光度法检测,NADH,生成量分析异柠檬酸脱氢酶活性,反应中异柠檬酸脱氢酶酶活性的检测主要通过测定生成的,NADH,在,340 nm,吸光度。检测体系包括,120 mM,的,D,，,L-,异柠檬酸三钠,，,30 mM,的硫酸锰,20 mM,的,NAD+,及异柠檬酸脱氢酶。,48,三、采用分光光度法测定,NADH,生成量分析,-,酮戊二酸脱氢酶活性,通过测定,NADH,在,340 nm,时吸光度的变化反映,-,酮戊二酸脱氢酶复合体酶活性。检测体系包括,1.0 ml,的磷酸盐；,0.15 ml,的辅酶,A,；,0.1 ml,的半胱氨酸,; 0.1 ml NAD,+,；,0.5ml,的酶。,49,四、采用分光光度法测定顺乌头酸生成量分析顺乌头酸酶活性,检测体系包括,100 mmol/L,的氯化钠，,30 mmol/L,柠檬酸钠, 20,mmol/L,Tris/HCl,和酶，在,1.00 ml,反应终体积，,pH 7.4,的溶液中，反应在,25,进行，通过检测顺乌头酸在,240nm,的吸光度反映顺乌头酸酶的酶活性。,50,
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