现代生药学概论

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,现代生药学概论,分子生药学部分,Molecular Pharmacognosy,1,第一篇 概论,第二篇 分子生药学研究方法及其基本技术,第三篇 分子生药学的研究领域,内容,2,1 生药及生药学的定义2 生药学的发展历程3 分子生药学产生的背景4 分子生药学定义及其研究对象,5 分子生药学研究内容,6 分子生药学研究的方法,7 分子生药学及相关学科的关系,第一篇 概论,3,一、生药及生药学的定义,生药:来源于天然的、未经加工或只经简单加工的植物、动物和矿物药材。相当于中药材。另外直接用于医疗保健或作为医药用原料、辅料的天然药物，也列入生药的范畴。如植物中制取的淀粉、粘液质、挥发油；自植物和动物中制取的油质、蜡类，以及某些医用敷料如石棉、滑石粉、白陶土等。,生药学：（Pharmakognosie, Pharmacognosy ）：,简单讲：是应用现代科学技术,对生药进行综合研究的一门科学。,详言之：生药学是利用本草学、植物学、动物学、化学（包括植物化学、药物分析化学、生物化学等）、药理学、中医学、临床医学和分子生物学等学科的理论知识和现代科学知识，来研究生药的名称、来源、生产、采制、鉴定、化学成分、品质评价、细胞组织培养、医疗用途及资源开发利用等方面的科学。,4,二、生药学的发展历程,大致可分为四个时期：,(1)传统本草学时期：从古代到19世纪初。对于生药的认识主要靠感官和实践经验，本草所记载的内容以医疗效用为主，兼及生药的名称、产地、形态和感官鉴别特征。,(2)近代商品生药学时期：1915-1930年，生药学成为一门独立的学科，当时主要的内容是研究商品生药的来源，鉴定商品生药的真伪优劣。在此期间，显微方法开始用于生药的鉴定，同时化学定性和定量方法也应用于生药鉴定中。,5,(3)现代生药学新时期：1930年-至今。主要体现在以下方面：, 生药有效成分研究进一步深入。 生药鉴定方面应用了电子显微镜和射线衍射法观察和研究生药组织的超微结构，免疫电泳法用于种子生药的鉴别，利用各种生药的紫外或红外光谱建立生药的指纹鉴别数据库的研究正在发展之中。 药用植物的组织培养，涉及到遗传育种和突变品系等多方面的研究，利用细胞和组织培养方法来生成药用植物的有效物质，已获得进展。 分类学研究的发展，通过生药化学成分的研究，作为分类学特征。 在资源开发利用方面，重视海洋药用生物的研究，并出现海洋生药学。有关生化药效、药效药理评价的临床生药学也已产生。,(4)自然生药学时期（20世纪末）：,本时期的最大特点是数理化科学原理及实验技术广泛应用于生药的研究中，使人们从宏观和微观来还原和揭示生药的自然属性。日本学者朝比奈泰彦的话“药学的研究从生药开始，最终又将回到生药的研究”，预示了生药学新时期的到来。,6,三、分子生药学产生的背景,生药研究存在的问题：,1 珍稀濒危药用资源和利用及保护,中国珍稀濒危植物保护物种388种，药用约102种，其中属中药33种。,2 “道地性”的研究,表现型phenotype=基因型genotype+环境饰变environmental modification,3 质量的控制研究,农药残留、重金属污染、有效成分等。,7,产生的理由：,(1)1953年Watson和Crick对DNA结构的发现标志着生命科学的发展进入了一个新纪元。,8,9,DNA双螺旋结构模型的生物学意义:第一次提出了遗传信息的储存方式以及DNA复制的分子机理。,10,(2)分子生物学快速发展并在生物医学各个领域渗透应用，使得一大批交叉学科、边缘学科和前沿学科应动而生，都发展到了分子水平。生药学主要研究动物和植物性生药，涉及到许多生物学的理论和方法，因此生药学也不例外。,(3)生药主要来源于动物和植物，任何植物、动物的每个细胞中都含有储藏、复制和传递遗传信息的物质基础DNA，这也是分子生物学研究的物质基础，使分子生物学的理论和方法能在生药学中广泛使用。,(4)从生药学研究动物性和植物性生药的层次来看，已逐渐从有机体、组织、器官、细胞发展到基因水平，所以发展生药学的科学现代化，必然要及分子生物学密切联系，理所当然地将生药学的研究推进到分子水平。,11,四、分子生药学定义及其研究对象,分子生药学：在分子水平上研究生药的鉴定、生产和成分的一门科学，所依据的主要是生药学及分子生物学的理论和方法，是生药学的一个极富前瞻性和前景性的分支。,研究对象：主要为植物、动物性生药，只是研究层次是在基因水平。,基因细胞器官有机体居群群落等6个主要的生物层次。（生物学谱）,12,五、分子生药学研究内容,分子生药学研究内容的科学内涵就是研分遗传物质DNA的异同及其表达及生药真伪优劣的关系，其中遗传物质DNA的表达是分子生物学要控索研究的难点之一。,具体内容：,(1)鉴定生药：形态分类学RFLP、RAPD等。,(2)生产方面：抗病虫害、道地性药材等。,(3)有效成分方面：转基因器官培养技术。,13,六、分子生药学研究的方法,生药学的研究就是为了控制生药的“真伪优劣”，从而为临床提供货真质优的生药。研究生药学的方法按不同学科的应用分为：,1.分类法的研究方法：将原料药的原植物或动物，进行分类学的研究，从而定下其品种，解决原动物或植物的品种混乱问题。涉及的方法有RFLP（Restraction Fragment Length Polymorphism）、RAPD（Randomly Amplified Polymorphic DNA）、AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）等。,2.化学研究方法：对生药的化学成分，进行定性和定量的测定。因为化学成分是药效的物质基础，又是加工炮制和制剂制备的基础。此法为生药质量控制提供客观而具体的指标。TLC、HPLC、CE、MS等。,14,3.物理学研究方法：包括生药本身的物理性质的测定和在形态、化学、生物活性等方法研究中对物理仪器的使用。药物本身的物理性质包括水分多少、颜色、硬度乃至形态等。水分含量测定，显微镜、电子显微镜对生药的组织形态鉴定等。,4.药效学研究方法：药物的质量控制，最根本指标或称标准是其药效如何。中医理论指导或临床实验指导。,15,七、分子生药学及相关学科的关系,生物化学,分子系统学,中药鉴定学,中药资源学,天然药物化学,保护生物学,药用植物育种学,生药学,分子生物学,分子生药学,药用植物学,16,1 植物DNA方法及技术2 植物RNA方法和技术3 植物基因表达和调控的研究技术分子杂交,核酸分子杂交 Westren杂交,4 植物遗传转化技术植物基因枪转化技术5 及分子生药学相关的Internet应用,第二篇 分子生药学研究方法及其基本技术,17,植物DNA、RNA的分离技术,核酸的分离及提取是分子生物学研究中很重要的基本技术。样品质量将直接关系到实验的成败。但是不同的研究目的对DNA的纯度和量的要求不同，因此提取方法也不同。,一般而言，一个好的DNA分离程序应符合以下3个主要标准：,（1）所得DNA纯度应满足下游操作的要求：如用于RFLP分析的DNA，其纯度的要求为可用限制性内切酶完全酶解并可成功地转移到膜上进行Southern杂交；用于PCR分析的DNA则不应含干扰PCR反应的污染物。,（2）所得DNA应当完整，电泳检查时可给出准确性高、重复性好的迁移带型。,（3）所得DNA应有足够的量。另外，操作方法应当快速、简便、价格低廉，并尽可能避免使用有毒试剂。,18,CTAB（Cetyltrimethyl Ammonium Bromide 溴化十六烷三甲基铵）法,CTAB是一种去污剂，这种方法的原理是：一定浓度的CTAB及核酸结合并通过离心形成CTAB-核酸复合沉淀，而多糖等成分留在上相中。要使CTAB-核酸复合物的分开则先溶于高盐溶液中，再用乙醇沉淀核酸，CTAB溶于乙醇中。所得核酸DNA大小为20-50kb。很少有RNA干扰，必要时可用RNase去除残留RNA。,19,RFLP技术,生物个体间的差异，本质上是DNA水平上的差异。这是由于进化过程中种种原因引起的基因突变和DNA分子结构重排，造成了分子内核苷酸排列顺序的改变，当这种改变涉及到限制性酶切位点时，即称为限制性片段长度多态性(RFLP)。多态即非单态性，不一样之意。也就是说，如果两个DNA分子完全相同，用同剂量的同种限制性内切酶在相同条件下消化，所得的限制性内切酶谱将相同。如果两个DNA分子基本相同，只是在一处或几处发生某种差异，哪怕是很小的差异，消化后两DNA分子的限制性酶谱的条带方式将出现不同，即产生多态性。,20,DNA多态性根据其产生的方式基本分为两种：一是碱基对突变类型，即限制性内切酶识别位点是发生了单个碱基替换，使原有切点消失或产生新的切点；另一类是结构重排型，这是由DNA内部发生较大的顺序变化引起的。,21,RFLP分析在分子生药学中的应用,1.品种及种质资源的鉴定,2.促进异源种质的转移和利用,3.研究药用植物的亲缘和进化关系,4.检测及RFLP标记连锁的主基因,5.构建RFLP标记及数量性状遗传位点的连锁图,22,DNA及PCR技术,23,PCR技术,24,PCR循环扩增原理示意图,25,PCR技术在分子生药学中的应用,1.对属性特异的DNA序列扩增和直接测序以用于系统发育或亲缘关系的分析，也可用于鉴定品种；,2.通过简单纯化从复杂生物样品的混合物中鉴定病原体和土壤微生物，用于药用植物的基因工程。,26,RAPD技术,RAPD的特点:,1.无需专门设计RAPD扩增反应的引物,也无需预知被研究的生物基因组核苷酸顺序,引物是随机合成或是任意选定的。引物长度一般为9-10个寡核苷酸。,2.每个RAPD反应中，仅加单个引物，通过引物和模板DNA链随机配对实现扩增，扩增没有特异性。,3.退火温度较低，一般为36,，这能保证短核苷酸引物及模板的稳定配对，同时也允许了适当的错误配对，以扩大引物在基因组DNA中配对的随机性。,4.较之常规PCR，RAPD反应易于程序化。利用一套随机引物，得到大量DNA分子标记，可以借助计算机进行系统分析。,27,RAPD分析在分子生药学中的应用,1.药用生物多样性：应用RAPD技术进行药用植物生物多样性研究，可以在遗传多样性水平上了解天然产物多样性及物种、生态及地理分布的关系，挖掘潜在的药物资源，为开发新药寻找途径。,2.RAPD标记可用于生药鉴别，在DNA分子水平上鉴别生物不同种、亚种、变种甚至株。,3.RAPD标记亦可用于遗传连锁图谱的构建，指导药用植物育种，防止品种间杂化和自交，选育优良性状品种。,28,AFLP技术,AFLP 技术(Amplified Fragment Length Polymorphism扩增片段长度多态性，是1993 年由荷兰KEY-GENE 公司的科学家Zabeau和Vos创建发展的一种新的DNA分子标记技术及检测DNA多态性的新方法，并于1993 年获得欧洲专利局专利。,AFLP 技术是限制性片段长度多态性(RFLP) 和聚合酶链式反应(PCR) 技术相结合的产物，可用于所有物种。它克服了RFLP技术复杂、RAPD 稳定性较差的缺点，又兼具两者之长。AFLP 标记多态性强，谱带丰富且清晰可辨，试验结果稳定，重复性好，被认为是一种较为理想的、高效的分子标记技术。,29,AFLP 技术的基本原理是通过对基因组DNA 的限制性酶切片段进行选择性扩增而揭示其多态性，亦即将基因组DNA 经限制性内切酶双酶切后，形成分子大小不等的限制性酶切片段,酶切后的DNA 片段连上接头形成带接头的特异片段，作为PCR 扩增的模板，特异性片段经PCR 扩增，只有那些及引物的选择性碱基严格配对的DNA 片段才能被扩增出来，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳将特异的限制性片段分离。,基本原理及优点,AFLP 技术的特点是DNA 用量少、灵敏度高，不需要预先知道基因组的信息。一般一次反应可得到50150 个扩增片段，尽管其多态性不一定是最高的，但一次试验能比其它标记得到更多数量的带，被认为是效率最高的标记。AFLP 采用长引物和更高的退火温度进行PCR ，比RAPD 等其他以PCR 为基础的分子标记具有更好的重复性。,30,AFLP在分子生药学中的应用,AFLP技术可产生丰富而稳定的遗传标记，它可以用于药用植物遗传分析的各个方面，如分类、系统发育、品种鉴别、遗传图谱构建及目的基因的定位等。,31,植物基因表达和调控的研究技术分子杂交,分子杂交技术从开始应用到现在已有30余年历史，最初出现的核酸分子杂交主要是在DNA及RNA之间进行。RNA是DNA的一条链转录而成的，因此RNA及DNA模板链之间存在对应的碱基互补关系。在碱性环境、加热或加入变性剂等条件下，双链DNA之间的氢键被破坏，两条链解开成为两条单链。这时如果加入其转录产物RNA并在一定离子强度和温度下保温，则RNA及模板链可形成稳定的RNA-DNA异质双链。形成异质双链的过程称为杂交。由于杂交是在分子水平进行的，所以称为分子杂交，形成的异质双链分子称为杂交分子。随后这一技术又发展到具有相似核苷酸序列的不同DNA分子之间的杂交，以及RNA分子、蛋白质分子之间的杂交。,32,分子杂交主要包括两大部分内容，一是核酸分子杂交，其中又包括Southern杂交和Northern杂交；二是属于蛋白质分子杂交的Western杂交。二者分别在基因整合、转录和表达的不同阶段对目的基因进行检测和定位。,分子杂交实验主要涉及三大部分的内容,：（1）杂交探针的制备；（2）被检的核酸或蛋白质样品制备；（3）印迹及杂交。,33,Southern杂交,Southern转移是用一块硝酸纤维素膜或尼龙膜贴在琼脂糖凝胶上，通过一定的机械压力以及毛细作用，在琼脂糖凝胶中的缓冲液渗出的同时也把DNA分子带出凝胶结合有膜上，使转移后的膜上“复制”有所有的琼脂糖凝胶中的DNA条带。用膜来作杂交不但方便得多，而且结果清晰，背景低。具体过程是将被检的DNA样品提取出来，用限制性内切酶酶切，生成的酶切片段中，必有目的基因片段或含目的基因序列的片段，用琼脂糖凝胶电泳分离，各片段按分子大小依次分开，排布在凝胶上。利用印迹技术将变性的各酶切片段由凝胶转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，经烘干或紫外线照射处理，使印迹的各片段及膜牢固结合，这样使各片段在膜上的相互位置及在凝胶上相同。,34,印迹完成后，经预杂处理，掩盖膜上的非特异性杂交位点后，将膜放入含有单链或经变性处理成单链的探针杂交液中，在适宜的条件下进行杂交。膜上及探针同源的单链序列，可通过碱基互补作用及探针杂交成双链，从而使探针固定在相应的位置上。目的基因及探针同源，凡含有目的基因的序列的片段都可以发生杂交，形成带标记的特异性杂交体。在杂交过程中或许也会发生一些非特异性的杂交及探针及膜上非特异性位点结合，这些非特异性的结合及未结合的游离的探针可以通过杂交后的漂洗过程而逐步除去。,35,（a）,（b）,（c）,（d）,（e）,基因组DNA,DNA限制片段,硝酸纤维素滤膜,同探针同源杂交的基因DNA片段,X光底片,36,Northern 杂交,经变性凝胶电泳分离的各RNA由凝胶转移到固相膜上称为Northern杂交。印迹原理及方法同于Southern杂交。,Western 杂交,Western杂交是检测蛋白质的一种方法。当目的基因正常表达时，细胞内会产生一定量的相应的特异蛋白，即目的蛋白。将此目的蛋白提取出来，溶解于含去污剂和还原剂的溶液中，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白质按分子大小分离，将分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜上，膜在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭非特异性位点。然后加入特异抗体（一抗），印迹上的目的蛋白（抗原）及一抗结合后，再加入能及一抗专一结合的标记的二抗，最后通过二抗上标记化合物的性质进行检出。,37,植物遗传转化技术,植物遗传转化（genetic transformation）是指利用重组DNA技术，细胞组织培养技术或种质系统转化等技术，将外源基因导入植物细胞或组织，获得转基因植物的技术。目前，转化技术大体可分为三类：,1,农杆菌,介导的基因转移。,2 以原生质体或细胞作为受体的直接基因转移。如电击、,基因枪法,、超声波法等。,3 种质系统的基因转移。如子房注射、种胚及花粉等途径导入外源基因。,38,基因枪法（particle bombardment, PB）,又称粒子轰击技术、生物发射技术或高速微粒子发射技术，是藉高速度运动的金属微粒将附着于其表面的核酸分子引入受体细胞的一种遗传物质导入技术。,优点：具有简易、快速、每枪所需DNA量少，而且可将外源DNA直接导入带壁的植物细胞，特别是通过叶绿体膜转入叶绿体，这是其它方法所难于比拟的。,39,1 药用植物的分子系统学研究2 药用植物种质资源的分子生物学研究3 生药鉴定的分子标记研究4 药用植物有效成分基因调控研究5 药用植物转基因器官和细胞培养生产天然活性化合物,第三篇 分子生药学的研究领域,40,一、分类系统学研究,（一）、分类系统之演变:,人为分类系统：本草纲目草谷菜果木,进化论前的自然系统：主要以形态亲缘关系分类为基础，没有反映亲缘进化关系。,系统发育系统：物种起源、恩格勒系统、哈钦松系统等。,41,（二）、研究方法之演变,1.传统分类法:,2.解剖分类法:,3.胚胎分类法:,4.细胞分类法:,5.化学分类法:,6.数值分类法:,7.分支分类法:,8.分子系统学:,42,（三）、分子系统学定义、内涵及意义,用分子生物学方法解决系统分类学的问题，为不同分类群的命名，划分及相互间的关系提供DNA或RNA的遗传依据的方法和理论，称为“分子系统学”。,药用植物的分子系统学研究也就是用分子系统学的方法和理论对药用植物的亲缘进化进行研究。,意义：1 进行药用植物的鉴定和分类：,2 寻找新的药用植物：,药用植物的亲缘关系化学成分疗效,3 保护药用植物资源：,43,例子,44,二、药用植物种质资源的分子生物学研究,种质资源是药用植物生产的源头，种质的优劣对药材(生药)的产量和质量具有决定性的作用，种质资源学是一门专门研究作物品种的好坏并从中选优去劣的科学，药用植物种质资源研究是生药研究的基础和起点，对生药的开发和可持续利用起着至关重要的作用。,（一）、定义：广义的“药用植物种质资源”是泛指一切可用于药物开发的植物遗传资源，是所有药用植物物种(包括种下分类单位)的总和。狭义的“种质资源”通常是就某一具体物种而言的，加“人参的种质资源”、“贝母的种质资源”、“红花的种质资源等，实际上主要是就“品种”而言的，是包括栽培品种(类型)、野生种、近绿野生种和特殊遗传材料(多倍体、单倍体、双单倍体、单体、三体、缺体及易位系、附加系、代换系等野生或人工诱导的变异材料)在内的所有可利用的遗传材料。,45,（二）、种质资源研究的重要意义,1 种质资源是发现和利用基因资源的源泉；,种质资源是基因的载体，植物种内所有个体及其遗传性状的基因构成了该物种的基因体。其中可能蕴藏着丰富的巳知或未知的有益基因，如控制高产、抗病、抗逆等优良性状的基因和控制有效成分代谢途径和代谢速度的基因。种质资源遗传多样性的研究将为评估基因资源的开发前景提供重要信息。,2 种质资源是引种栽培和资源保护的基础；,种质资源有效成分的遗传变异是影响药品产量和质量的重要因素，要获得好的疗效和经济效益在引种之前，首先必须在众多遗传资源中筛选出最有用的遗传资源，以便在消耗同等数量物资的情况下获得更多的产品。,3 种质资源为育种提供了原始材料；,任何一个新品种的培育都是在原有的植物资源基础上通过选择、杂交、回交、诱变等方法修饰、加工、改良后培育出来的。,4 种质资源是实施GAP的保证。,46,（三）、DNA指纹的概念及应用,1. DNA指纹技术是近年来发展起来的一组可以检测出大量DNA位点差异性的分子生物学新技术，因它们的电泳谱带类似人的指纹图形而得名，如RAPD、RFLP、AFLP等。,2. DNA指纹技术在药用植物种质资源研究中的应用,(1) 在品种品系鉴定上的应用,(2) 在品种品质纯度检测上的应用,(3) 在种质资源遗传多样性研究上的应用,(4) 在种质资源遗传关系研究上的应用,(5) 在作物育种上的应用,47,三、生药鉴定的分子标记研究,传统生药鉴定研究:,1 基源鉴定,2 性状鉴定,3 显微鉴定,4 理化鉴定,5 生物鉴定,48,生药DNA分子鉴定技术:,1 基于传统的Southern杂交技术的分子标记,如RFLP等;,2 基于PCR反应的分子标记,如RAPD等;,3 PCR-RFLP技术的结合即AFLP技术;,4 测序技术,生药DNA分子 鉴定的应用:,1 近缘生药品种的DNA分子鉴定;,2 名贵易混淆生药的DNA分子鉴定;,3 动物类生药的DNA分子鉴定;,4 药材道地性的DNA分子鉴定;,5 生药野生及家种(养)的DNA分子鉴定;,6 特殊药材的DNA分子鉴定;,7 生药质量标准化的DNA分子刻划;,8 中药原粉制剂的DNA分子鉴定;,9 中医药古迹的DNA分子辅助考证;,10 药用植物种子种苗纯度及雌雄的DNA分子鉴定;,49,四、药用植物有效成分基因调控研究,方法:药用植物基因转化技术(参考前面的内容),调控的途径:,1 把药用植物某种有效成分生物合成中的某个关键基因利用上述转化技术导入该种药用植物,以增加此关键基因的表达量,从而达到提高目的有效成分生物合成水平的目标.,2 反义技术的应用.反义技术是根据碱基互补原理,通过人工合成或者是生物体合成的特定互补的DNA或RNA片段(或者是其化学修饰产物),抑制或封闭某些基因表达的技术.,3 通过控制药用植物有效成分生物合成基因的调节基因(如转录激活因子)的表达来增加目的产物的含量.,50,类萜生物合成途径及其参及的酶类,51,五、药用植物转基因器官和细胞培养生产天然活性化合物,目前，许多中草药都面临野生资源逐年减少和栽培品种品质下降的问题，给临床使用和中成药制造带来一定的困难。由,根癌农杆菌和发根农杆菌感染,药用植物形成的,冠瘿瘤和发状根,这二种转基因器官，由于生长迅速，生化性质和遗传性稳定以及易于进行基因操作等特点。近年来，已发展成为继细胞培养后又一有用的培养系统。利用冠瘿瘤和发状根这二种转基因器官培养系统工业化生产药用植物的有效成分将为中药材新资源研究提供一条可行的新途径，为最终解决我国中药品种短缺和质量不稳提供确实有效的办法。,52,讨论题目,1.药用植物遗传转化技术在分子生药学的应用（提高有效成分含量、获得抗病虫害的特性等）。,2.生药鉴定的分子标记研究在分子生药学的应用（,RFLP、RAPD、AFLP,等）。,3.生药有效成分的调控或生产（有效成分基因调控、细胞组织培养生产天然化合物）。,要求：,1 说明原理、材料、运用的方法、获得的结果及结论；并运用此方法设计一课题(立题依据、方法、预期结果等)。,2 综述介绍。,53,