2011 第二单元 二相反应

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,药物的二相代谢及其分子酶学,二相代谢反应及代谢酶系,人体内的葡萄糖醛酸结合及其影响,1,II,相反应,在化合物的反应基团,(,或,I,相反应新形成的基团,),上，结合极性基团，增加产物的水溶解性能。结合反应,.,-,OH, -SH, -COOH, -CONH,葡萄糖醛酸基化,-OH,磺酸基化,-NH2, -CONH2,乙酰基化,-,卤素, -,硝基,环氧化物,硫酸基 谷胱甘肽结合,反应产物水溶性增加，减少重吸收，增强外源性化合物的清除,.,结合反应可分为两种类型,:,药物,+,活化的结合基团, 产物,活化药物,+,结合基团 产物,II,相生物转化的化学反应类型,2,例,1,儿茶酚类,多酚类化合物，拟肾上腺素或抗氧化剂药物,3,对乙酰氨基酚乙酰苯胺类解热镇痛药。通过抑制环氧化酶，选择性抑制下丘脑体温调节中枢前列腺素的合成，导致外周血管扩张、出汗而达到解热的作用；通过抑制前列腺素等的合成和释放，提高痛阈而起到镇痛作用，属于外周性镇痛药。无明显抗炎作用。,4,2.1.1,与糖基结合,2.1.2,与硫酸结合,2.1.3,乙酰化结合,2.1.4,氨基酸结合,2.1.5,谷胱甘肽结合,2.1.6,甲基化,1,）,O-,甲基化,2,）,N-,甲基化,2.1,二相代谢反应及代谢酶系,5,2.1.1,与糖类的结合反应,人体内发生结合反应的糖类主要为葡萄糖及其衍生物,木糖和核糖,.,但最主要的是,-D-,葡萄萄糖醛酸（,GA,）及其衍生物的结合反应,.,糖基的活化形式是,UDP-GA,通过亲核反应机制，与药物或药物代谢中间体上的,OH,，,COOH,，,NH2,，,SH,等官能基团发生缩合反应而形成糖苷键。,6,人体中发生,葡萄糖醛酸基化,的反应所占比例相当大，而,葡萄糖基化,的药物主要是酚类和羧酸类物质，比例较小。催化葡醛酸转移的酶称为,UDP,葡萄糖醛酰基转移酶（,UDP glucoronosyl transferases,，,UGTs),。,UGTs,酶与,CYPs,酶相类似,也是属于微粒体酶超家族蛋白质成员,对许多内源性和外源性物质发生催化作用,以利于原药经过反应后溶解于水,容易排出体外。,7,实例,:,内源性甾体激素,(,包括雌激素,雄甾酮和孕激素等,),大多经过,GA,化失活,.,治疗晚期乳腺癌的新药氟维司群,Fulvestrant,其,3,和,17,OH,都容易结合葡醛酸基,.,8,1,）醚型或,O-,葡萄糖（醛酸）苷,化学反应通式：,R-OH+ UDP-G,（,A,）,R-O-G,（,A,）,+ UDP,UDP-G(A),转移酶,9,葡糖基结合物一般被认为是纯粹的内外源物解毒形式,但事实上并不完全正确,.,吗啡因在葡萄糖基化后,其活性更高,.,一些药物的糖醛酸结合物,10,吗啡不同位置发生糖基化后的产物，其生理效应不同。小鼠实验中，,6-O-,糖苷产物的镇痛效应为母药的,45,倍。,作业：吗啡的体内代谢及其药理作用,1. R. J. Osborne, S. P. Joel, D. Trew and M. Slevin,Lancet,1988,i, 828,2. F. Scheinmann, K. W. Lumbard, R. T. Brown and S. P. Mayalarp, International Patent WO 93/3051, 1993,3. A. V. Stachulski, F. Scheinmann, J. R. Ferguson, J. L. Law, K. W. Lumbard, P. Hopkins,N. Patel, S. Clarke, A. Gloyne and S. P. Joel,Bioorg. Med. Chem. Lett.,2003,13, 1207.,11,UDPGA,也可以与底物羧基反应,形成酯型葡萄糖醛酸苷,作业：灰婴综合症或高胆红素血症的代谢机理是什么？,含羧酸基团的药物可以通过葡萄糖醛酸转移酶的代谢转化,形成亲电子活性的酰基葡萄糖醛酸苷活性中间代谢产物,然后经过一系列的非酶或酶反应形成,蛋白加合物或,DNA,加合物。,Zhou SF, Xue CC, Yu XQ, et al. Metabolic activation of herbal and dietary constituents and its clinical and toxicological implications: an update J. Curr Drug Metab, 2007, 8: 526- 553.,12,2,）硫醚或,S-,葡萄糖醛酸酸苷,含巯基的药物，可与葡萄糖醛酸基形成硫醚键。如用于治疗成人甲状腺功能亢进药物丙基硫氧嘧啶,13,对于,N-,糖苷的研究目前尚不深入广泛,抗乳腺癌药,Tamoxifen :,N,-glucuronide may be partly responsible for its activity.,（,枸橼酸他莫昔芬片用于治疗乳腺癌。适用于治疗女性复发转移乳腺癌，或用作乳腺癌手术后转移的辅助治疗，预防复发。,),T. Kaku, K. Ogura, T. Nishiyama, T. Ohnuma, K. Muro and A. Hiratsuka, Biochem. Pharm., 2004,67, 2093.,3,）,N-,葡糖醛酸苷,14,肠肝循环,指由肝脏排泄的药物，随胆汁进入肠道后，因为酶水解释放药物原型，再吸收而重新经肝脏进入全身循环的过程。主要发生在经胆汁排泄的药物中。,在胆汗排泄的葡萄糖醛酸结合物在肠内易发生酶促水解,游离出的药物又可被肠重吸收,使药物在体内保持的时间较长,一些由胆汁排入肠道的原型药物如毒毛旋花子苷,G,，极性高，很少能再从肠道吸收，大部分从粪便排出。有些药物如氯霉素、酚酞等的葡萄糖醛酸结合物排入肠道，在肠道细菌酶作用下水解释放出原型药物，可以又被肠道吸收进入肝脏。,动物实验显示，抗菌药物抑制肠道细菌后，可降低某些药物的肝肠循环，改变其药物代谢动力学性质，影响药效。,15,Why are carbohydrate metabolites important?,Recent guidelines issued by the,FDA-Metabolites in Safety testing (MIST),All metabolites accounting,for 10% of drug dose,must in general be screened,for toxicity/ safety,Among these, glucuronides- especially,acyl glucuronides-,were specifically mentioned,Have to developed effective synthetic routes for a wide range of glucuronide metabolites and the basis for toxicological studies,to get better understanding of,structure-activity properties,of the metabolites and studying protein interactions, especially through proteomics,16,2.1.2,与硫酸结合,反应在不同的转磺酶催化下进行,(,酚转磺酶,醇转磺酶,甾体转磺酶,芳胺转磺酶,),，甾体类激素药物、儿茶酚类药物等富含羟基的药物容易发生磺基化反应。,17,PAPS,的合成,=,硫酸基团活化,18,实例,对乙酰氨基酚，扑热息痛,19,大多数内外源性化合物能被,GA,化这也能被磺化,因此存在竞争,.,一般认为,底物浓度决定哪种代谢途径占优：,GA,化在高底物浓度时占优势,而磺化在低底物浓度时占主导,.,20,2.1.3,乙酰化结合,在乙酰基转移酶的催化下,由,乙酰辅酶,A,传导乙酰基,与底物氨基结合而发生。蛋白质氨基酸残基也常常被乙酰化修饰。,芳伯胺药物在代谢时大都被乙酰化结合；酰胺类药物在水解后、芳硝基类药物在还原后形成的氨基等，都可能进行乙酰化结合。,蛋白质氨基酸氨基,反应分为两步进行：,21,实例,:,磺胺类药物的乙酰化,一般药物经,N-,乙酰化代谢后，生成无活性或毒性较小的产物。,N-,乙酰化转移酶的活性受遗传因素的影响较大。故有些药物的疗效、毒性和作用时间在不同民族的人群中有种族差异。,22,Phenacetin,1887,Acetaminophen,扑热息痛,1893,75-80%,Metabolic pathway quantified,(Brodie &Axelrod, 1948),popular in US since 1955,扑热息痛毒性：,overdose results in more calls to poison control centers in the US than overdose with any other pharmacologic substance.,The American Liver Foundation reports that 35% of cases of severe liver failure are caused by acetaminophen poisoning which may require organ transplantation.,N,-acetyl cysteine is an effective antidote, especially if administered within 10 h of ingestion NEJM 319:1557-1562, 1988,CYP1A2,实例：,CYP1A2 Mediated Phenacetin O-deethylation,23,60%,35%,CYP2E1*,CYP1A2,CYP3A11,NAPQI,N-acetyl-p-benzoquinone imine,*induced by ethanol, isoniazid,Protein adducts,Oxidative stress,Toxicity,UGTs,药酶介导的扑热息痛生物转化与毒负反应,24,2.1.4,氨基酸结合,(,药物活化后再反应）,许多羧酸类药物或代谢中间体在体内通过酶催化,形成,CoA,衍生物后,与内源性胺类物质,(,氨基酸,),形成结合物,.,特点,:,羧酸类物质,(,芳香羧酸,杂环羧酸,),R-CoA,衍生物,(N-,乙酰化转移酶催化,),氨基酸,(,以甘氨酸、谷氨酰胺最为常见,，,),甘氨酸,25,溴苯那敏的代谢,功效主治：丙胺类抗组胺药，镇静作用弱。用于皮肤粘膜、过敏性疾病。,26,2.1.5,谷胱甘肽结合,27,谷胱甘肽是机体内重要的三肽物质,保护细胞内多种亲核基团物质如蛋白质、核酸还原状态,维持细胞稳定,解除药物,/,毒物的毒性,.,其结构为谷氨酸,-,半胱氨酸,-,甘氨酸,分子中的,Cys-SH,是发挥生理功能的重要基团,与环氧化物,卤烷烃,硝基烷烃,/,芳烃等类物质结合,.,28,催化谷胱甘肽结合反应的酶是,谷胱甘肽,-S-,转移酶,(GSTs),主要在肝、肾、肠等组织。,在细胞中，,GSTs,分布在胞液、线粒体和内质网（及微粒体）等部位。在有些哺乳动物细胞中，,GST,蛋白质可以达到细胞液总蛋白量的,10,。也是一个超家族酶系，一般，同工酶分子量,45,55kDa,， 据基因序列相似性和免疫特异性分为,，,，,和,四个亚家族。,GST,基因表达具有组织特异性，且在正常组织和癌组织中有显著性差异，后者高水平表达，因此是肿瘤标记之一。采用同工酶专属,GSH,类似物作为抑制剂调节,GST,活性，是抗癌药的研发的一种思路。,作业：人体中的重要硒蛋白？,29,谷胱甘肽,S-,转移酶是谷胱甘肽结合反应的关键酶，主要存在于胞液中。谷胱甘肽,S-,转移酶有多种形式，根据作用底物 不同，至少可分为：,1,、谷胱甘肽,S-,烷基转移酶：催化烷基卤化物和硝基烷类化合物的谷胱甘肽结合反应。主要存在于肝脏和肾脏。,2,、谷胱甘肽,S-,芳基转移酶：主要催化含有卤基或硝基的芳烃类或其它环状化合物的谷胱甘肽结合反应，如溴苯和有机磷杀虫剂等。该酶主要存在于肝脏胞液。,3,、谷胱甘肽,S-,芳烷基转移酶：催化芳烷基的谷胱甘肽结合反应，例如，苄基氯等芳烷卤化物等。主要存在于肝脏和肾脏。,4,、谷胱甘肽,S-,环氧化物转移酶：催化芳烃类和卤化苯类等化合物的环氧化物衍生物与谷胱甘肽结合，主要存在于肝肾胞液。,5,、谷胱甘肽,S-,烯烃转移酶：催化含有,，,-,不饱合羰基的不饱合烯烃类化合物与谷胱甘肽的结合反应，主要存在于肝肾胞液。,30,31,实例：,32,谷氨酰胺结合物还可以进一步在酶催化下，逐级分解，最终产生硫醚氨酸或巯基尿酸。,R,R,谷氨酰胺酶,肽酶,乙酰基转移酶,33,巯基尿酸结合,谷胱甘肽结合物可直接从尿液、胆汁中排泄也可继续代谢：,-,脱去谷氨酸和甘氨酸，再将乙酶辅酶,A,的乙酰基转移到半胱氨酸的氨基上,􀂃,-,形成巯基尿酸排出体外,34,大剂量对乙酰氨基酚中毒：,代谢物与谷胱甘肽的结合为主要的代谢途径,􀁺体内供结合用的葡萄糖醛酸和硫酸盐被耗尽,当肝脏内谷胱甘肽的消耗无供应时，会使代谢物,N-,乙酰对苯醌亚胺在体内蓄积,亲核性的代谢物可与细胞内大分子共价结合,35,2.1.6,甲基化反应,甲基化反应不能改善水溶性,但一般降低药物的反应性,甲基化供体为,SAM(S-adenosylmethiomine),底物,:,胺类,醇羟基,酚羟基,咪唑基团等,各种甲基转移酶,对一些儿茶酚胺如肾上腺素的灭活代谢起着重大的作用）,36,甲基化反应特点 甲基化反应特点,含,N,、,O,、,S,的基团都能进行,需在甲基化转移酶催化下进行,在镁离子和儿茶酚,-3-O-,甲基转移酶,(COMT),的催化下，可使儿茶酚结构的药物甲基化,苯乙醇胺,-N-,甲基转移酶（,PNMT,）可催化苯乙醇胺类如麻黄素甲基化,37,38,百浪多息,(,一种磺胺类药）,39,2.2,尿苷葡萄糖醛酸转移酶（,UGTs,）,外源化合物 （,Xenobiotics,）的二相代谢最主要酶是,UGTs,。机体中，存在多种,UGTsd,基因形式，形成,UGT,超家族。,目前通过对典型的,UGTGA,解毒机制研究，已经证实人体各种,GA,结合反应均有由,15,种,UGT,酶催化，各个,UGT,同功酶的底物享有一定的重叠性，即,绝大多数情况下，底物结合,GA,后失活，只有极少数例外。,一种,UGT,酶可以催化多种底物,GA,结合,一种底物可以被多种,UGT,酶催化,GA,反应,40,UGTs,与,CYPs,的差别：,在内质网上的定位：,UGTs,蛋白质大部分在内质网内腔，因内质网膜屏障药物及辅因子进入而造成代谢滞后现象；,CYPs,则锚定在内质网膜靠细胞溶胶侧，蛋白质及其活性中心均在细胞液中。,UGTs,家族成员，蛋白质,C-,端结构氨基酸序列同源性较高，而,N,端的变异性大。一般认为前者是葡萄糖醛酸基结合域，后者则是决定酶的底物选择性的区域。,UGT1A,家族成员，一般基因结构上共有,5,个外显子，只有第一个外显子各异，而其余,4,个外显子相同。,41,编码,UGT1A,同工酶的基因簇在,2,号染色体长臂端,(2q37),该族基因的特点是含有,13,个可变的,exon 1,及其相应的启动子序列,接下来是共享的,2,3,4,5,四个外显子序列,已鉴定出四个,exon1,是假基因,(pseudogenes),。,每一个,5,-,端的,exon1,都可以与后面的四个外显子拼接形成,9,种不同的,UGT,酶,即,N,-,端不同,(,识别底物,),而,C-,端相同,(,结合糖醛酸,),的,UGTs,各个,exon 1,编码 底物结合区域并受到自有的启动子调控,.,2.2.1 UGT1A1,基因家族,42,UGT1A1,基因启动子特征,TATA,启动子区域,Variable repeats of thymine-adenine (TA),WILD TYPE promotor (,UGT1A1*1) =,6 TA repeats,3 variant alleles with 5, 7 and 8 TA repeats,(TA),5, (TA),7, (TA),8,respectively.,(TA),7,polymorphism ,UGT1A1*28,Homozygous genotype,10% of North Americans,2 alleles have 7 TA repeats, 7/7,(TA),5,& (TA),8, less common, African origin,43,UGT,基因发生突变,可能引起一系列的病变,包括胆酸代谢异常和癌症发生,.,Gilbert syndrome,(GS) :,最初被普遍认为是,UGT1A1,启动子序列中插入,TA,碱基所致,但续后研究发现约,40%,人群具有该突变却并无高胆红素症,.,说明此突变是高胆红素症的必要但非唯一条件,.,目前已证实,与其它的,UGT1A1,突变结合, GS,症风险增加,.,非结合性高胆红素血症,Hyperbilirubinemia familial transient neonatal,(also called,breastfeeding jaundice,),亦与,UGT1A,突变相关,.,单纯,UGT1A,突变对于女性不会造成严重的高胆红素症,但当其哺乳时,由于乳汁中的类固醇物质可能抑制婴儿体内胆红素葡醛酸化,导致哺乳性黄疸,(jaundice),甚至膽紅素在血清中過度的升高，而使得膽紅素沉積在腦部基底核及海馬處等神經核內，稱之為核黃疸,kernicterus ,发生神经系统损伤,.,44,UGT1A,基因多态性与胃肠道肿瘤易感性有相关性。近年来的分子流行病学调查表明，导致酶活性下降的基因突变，可能增加人群直肠癌、结肠癌、乳腺癌前列腺癌等风险。,45,UGT2A1,也称为,UGT2B1,位于,4,号染色体长臂端。主要分布在嗅觉组织，脑及胎儿肺中。,鼻粘膜神经上皮广泛地接触各种气体物质,.,气味物质常常是脂溶性小分子化合物,进入鼻腔后刺激神经原上的受体,.,嗅觉的感应过程是一过性的,一般是由上皮支持细胞中对嗅觉分子的生物转化实现对信号的终止,.,UGT2B1,等外源化合物代谢酶被认为在催化嗅觉分子失活和使之亲水而清除中起重要作用,.,2.2.2 UGT 2,家族,46,UGT2B,基因位于染色体,4q13. UGT2B4, UGT2B7,和,UGT2B15,等基因分布在,500-1000kb,的范围,其中还包含至少两个假基因,以及基因间的一些重复片段,.,相对于,UGT1A,成员，,2B,基因各自独立，但维持较高的序列同源性。,UGT2B15,与,UGT2B17,享有,95%,蛋白质一级结构同源性,主要表达在甾体激素靶器官,. UGT2B15,与,UGT2B17,基因高度保守,均由,6,个,exons,组成且具有相同的,exon-intron boundaries.,甚至在,5,-flanking region,也高度同源,并含有一些相同的顺式作用元件,包括,Pbx-1, C/EBP, AP-1, Oct-1,及,NF/kappaB.,但反式作用因子研究表明 基本启动子间二者有一定差异,.,The localization of highly homologous UGT2B genes and pseudogenes as a cluster on chromosome 4q13 reveals the complex nature of this gene locus, and other novel homologous UGT2B genes encoding steroid conjugating enzymes are likely to be found in this region of the genome.,Genomic organization of the UGT2b gene cluster on human chromosome 4q13. Pharmacogenetics. 2000 Apr;10(3):251-60,47,2.2.3 UGT,活性的体外研究,UGT,酶活性研究时，要适量加入表面活性剂，但又必须考虑适用量。过多，则可能对酶活性本身有抑制作用。,目前运用重组表达手段分别表达,UGT,酶蛋白，并且进行微粒体孵育实验测定,UGT,单酶的动力学性质，但争论犹存：主要是活体细胞可能存在酶的异二聚体，其对底物的选择性可能与单酶不同。,HepG2, Caco-2,细胞系,UGT,酶表现出活性潜伏特征，即由于酶蛋白细胞定位关系，导致,N-,端活性中心处于内质网内腔致使胞液中的底物不易与酶活中心接触，因而延迟,GA,化。这种现象，容易被膜破坏剂（如表面活性剂等）所解除。,48,2.2.3,葡醛酸反应的个体差异,与,CYP,酶相似，个体之间,UGT,酶代谢活性的差异也非常巨大，导致这些差异的原因亦报考包括遗传因素和环境因素。,遗传因素：基因多态性研究，目前以,UGT1A,的工作较多，,UGT1A1,已获鉴定的突变体早已超过,30,多个，其中,TATAA,框的突变是公认导致高胆红素症的主要原因。,转录诱导：许多药物，环境化合物以及食物都可能引起,UGT,转录水平增加。,UGT1A1,基因转录调控机制与,CYP1A2,的调控机制类似，主要受到核因子,AhR/AhNR,异二聚体的激活。环境或食物中的萘黄酮，多环芳烃，苯巴比妥等等，均为,AhR,的诱导剂，可以引起,UGT1A1,的表达上升，从而改变体内相关药物的代谢动力学性质。,49,酶活抑制：降糖药曲格列酮对,UGT1A6,有弱抑制作用，导致临床上约,2%,的病患在使用该药时，发生不可预测的肝脏毒性反应。,年龄差异：对,20,孕周、出生,6-24,月和成人肝脏进行的多种,UGTmRNA,水平比较研究结果表明，胎肝无,UGTsmRNA,，而婴儿和成人肝脏均有表达。一些,UGTmRNA,水平基本恒定，而部分,UGTs,的,mRNA,水平随年龄增加而增加。提示，在人类发生发育过程中，,UGTs,存在各自的调控机制。而一般，婴儿中,GA,结合机制并不健全，必须对经葡醛酸化的药物剂量进行调整。,生活习惯：吸烟,烟草多环芳烃可诱导,UGT1A6,，,1A9,等，导致机体葡醛酸结合反应能力增加，促进酚类药物清除；黄酮类化合物（如白杨黄素）对,UGT,有明显诱导作用。,50,种族差异：不同种族人群，,UGTs,基因多态性分布不同，种群间的,UGT,活性可能显著不同。对瑞典白人和华人之间可待因代谢研究证实，白种人使用可待因后，其尿液中的可待因葡醛酸苷为华人的二倍。反之，华人达到麻醉时所需要的可待因剂量也比白种人低。,而对于吗啡的药动学研究数据表明，华人的葡醛酸结合代谢途径反应更快，对吗啡的清除率更高。,激素因素：性激素影响一些,UGT,的活性。在所有有性别差异的药物代谢中，男性的,GA,结合能力均强于女性。该方面的研究尚不深入，激素参与多基因表达调控，也包括,CYPs,和,UGTs,的调控。,51,1.Comparative genomics analysis of human sequence variation in the UGT1A gene clusterUGT1A comparative genomics. M L Maitland, C Grimsley, H Kuttab-Boulos, et al, The Pharmacogenomics Journal 6, 52-62 (2006),2. The effect of UGT1A1 promoter polymorphism on bilirubin response to hydroxyurea therapy in hemoglobinopathies. Italia KY, et al. Clin Biochem, 2010,3. Combined UGT1A1 and UGT1A6 genotypes together with a stressful life event increase breast cancer risk.Justenhoven C, et al. Breast Cancer Res Treat, 2010,4. Pharmacogenetic analysis of lipid responses to rosuvastatin in Chinese patients. Hu M, et al. Pharmacogenet Genomics, 2010,5. Tukey RH, Strassburg CP (2000). Human UDP-glucuronosyltransferases: metabolism, expression, and disease. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 40: 581616,6.Jedlitschky G, Cassidy AJ, Sales M, Pratt N, Burchell B (1999). Cloning and characterization of a novel human olfactory UDP-glucuronosyltransferase. Biochem. J. 340 ( Pt 3): 83743,7. Uridine diphosphoglucuronosyltransferase pharmacogenetics and cancerUGT pharmacogenetics. Oncogene 25, 1659-1672 (2006),阅读参考：,52,思考问题,我国中草药研究中二相代谢方面进展？,谷胱甘肽酶与人体硒蛋白研究在老年性疾病研究中的应用？,UGT1,家族基因结构特征如何？,53,54,