生药有效性评价

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,单击此处编辑母版标题样式,1,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,生药的有效性评价,(,Efficacy evaluation of crude drug,),Which,methods could be used for,efficacy evaluation?,How,?,生药的有效性评价,(Efficacy evaluation ),生物检定法（,Bioassay,）,与疗效相关联的化学成分分析法,(Analysis of bioactive components),生药的生物效应评价法,定义：,它以药物的药理作用为基础、生物统计为工具，运用特定的实验设计，在严格控制的试验条件下，通过比较标准品和供试品对生物体或离体器官与组织的特定生物效应，计算供试品的效价（,Potency,）或者毒性（,Toxicity,）,，从而控制和评价供试品质量或活性。,生药的有效性评价方法之一：,对一些采用理化方法不能测定含量或理化测定不能反映临床生物活性的药物。如胰岛素、肝素、缩宫素及各种抗生素等。,微量生理活性物质。如,Ach,、,5-HT,某些有害杂质的限度检查如农药残留量、内毒素等致热物质、抗生素及生化制剂中降压物质的限度检查等。,应用范围：,中药及复方,:,中药成分复杂，大部分中药的有效成分尚未搞清，难以用理化方法加以控制，但可用一些以其疗效为基础的生物测定方法来控制其质量。,应用范围：,Example 1,洋地黄生物检定法,比较洋地黄标准品,(S),与供试品,(T),对鸽的最小公斤致死量，从而测定供试品的效价。,死亡前有强烈颤抖、恶心呕吐、排便等反应。最后至瞳孔放大、呼吸停止为注射终点。,抗凝血酶活性测定法：,水蛭提取物,牛纤维蛋白原,+,凝血酶,(,滴定,),至有凝固物出现,Example 2,水蛭抗凝血酶活性测定,淀粉酶活力测定法：,麦芽提取物,淀 粉,+,反应，,反应终止,麦芽糖,Example 3,麦芽中淀粉酶活力测定,a,b,淀粉酶,（底物）,3,，,5-,二硝基水杨酸,棕红色,（,540nm,）,生药化学成分分析法,生药的有效性评价方法之二：,定义：,应用范围：,两种评价方法的比较,生物,检定法,理化,分析法,测定结果能直接反映药物的效价；是理化分析法的有力补充,测定结果误差较大，重现性较差；加上测定费时，计算繁琐；难以构建合适的药理模型以反映中药整体作用的特点,测定结果重现性好，易于控制与推广,测定结果与活性之间的相关性差,Methods,Advantages,Disadvantages,一、紫外,-,可见分光光度法,(Ultraviolet-visible spectrometry),朗伯,-,比尔定律,:,A,=,ECL,1,、原理：,单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度成正比。,双光束扫描,扫描范围：,190nm800nm,常量池（,3ml,）和微量池（,50,120ul,）配置,UV Probo,软件操作系统,在操作系统控制下，可完成紫外可见光谱扫描、动力学测定、单波长和多波长的定量分析、数据图形处理以及规范化报告生成。,岛津,2450,型紫外可见分光光度计,2,、仪器,3,、紫外,-,可见分光光度法定量方法,对照品比较法,吸收系数法,标准曲线法,适用对象,:,生药中大类成分的含量测 定，如总黄酮、总蒽醌、总生物碱等。,4,、应用,槐花（米）中总黄酮的比色法测定：,药材提取物亚硝酸钠硝酸铝氢氧化钠,500 nm,处测定,平贝母中总生物碱的含量测定,酸性染料比色法,药材,总生物碱,pH5,溴百里香酚蓝,比色法测定,412 nm,二、色谱法,(Chromatography),薄层色谱法,(thin layer chromatography, TLC),气相色谱法,(gas chromatography, GC),高效液相色谱法,（,high performance liquid chromatography, HPLC,）,（一）薄层色谱法,(thin layer chromatography, TLC),薄层板,(plate),点样,(loading),展开,(developing),显色与检视,(visualization & detection),记录,(recording),1,、,TLC,一般操作程序,在计算机控制下，可自动完成点样展开显色扫描照像彩色图片输出等一整套工作程序,。,瑞士,CAMAG,薄层色谱扫描仪,2,、,TLC,仪器,中国药典,(2010,年版,),一部薄层色谱法用于定性鉴别的达,2000,多项。,多用于鉴别、限量检查,:,3,、,TLC,的应用,斑点颜色、,R,f,值,依据,简便、快速、适应性广、可操作性强,优势,薄层扫描法定量（,TLCS,）,3,、,TLC,的应用（定量分析）,酸枣仁中酸枣仁皂苷,A,、,B,的,TLCS,法测定,3,、,TLC,的应用（定量分析）,薄层色谱紫外可见分光光度法定量,（,TLC-UV,）,点样,展开,定位,刮板,洗脱,UV,测定,（二）高效液相色谱法,（,high performance liquid chromatography, HPLC,）,1,、,HPLC,仪,Agilent 1100 Series,HPLC Systems,硅胶,-,正相色谱,化学键合硅胶,-,反相色谱,离子交换填充剂,-,离子交换色谱,凝胶,-,分子排阻色谱,手性键合填充剂,-,对映异构体拆分,色谱柱,2,、,HPLC,仪组成,紫外检测器,(ultraviolet detector, UVD),二极管阵列检测器,(diode array detector, DAD),荧光检测器,(fluorescence detector, FLD),电化学检测器,(electrochemical detector, ECD),选择性检测器,检测器,2,、,HPLC,仪组成,示差折光检测器,(refractive index detector, RID),蒸发光散射检测器,(evaporative light-scattering detector, ELSD),质谱检测器,(mass spectrometrical detector, MSD),通用型检测器,检测器,2,、,HPLC,仪组成,Alltech 2000,蒸发光散射检测器,Agilent,液质联用仪,3,、,HPLC,定性方法,min,0,10,20,30,40,50,mAU,0,10,20,30,40,50,60,70,三个定性参数,:t,R,值、,UV,、,MS,nm,200,225,250,275,300,325,350,375,mAU,0,25,50,75,100,125,150,UV,m/z,100,200,300,400,0,20,40,60,80,100,211.1,189.1,399.2,227.1,M+Na,+,M+K,+,2M+Na,+,M+H,+,MS,内标校正因子法：,外标法：,面积归一化法：纯度检测,中国药典,(2010,年版）一部应用,HPLC,法测定含量的中药品种达,1700,余项。,HPLC,优势：,4,、,HPLC,定量方法,5,、,HPLC,的应用,7-epi-loganin,(1),sweroside,(2),loganin,(3),7-epi-vogeloside,(4),secoxyloganin,(5),1.,金丝桃苷；,2.,异槲皮苷,1.,金丝桃苷；,2.,异槲皮苷,1.,金丝桃苷；,2.,异槲皮苷,UPLC,的原理：,van Deemter,方程,UPLC,1.7 um Particle,2004s,UPLC,的优势,高分离度,高速度,高灵敏度,Agilent RRLC,Shimadzu UFLC,Agilent,6890N,型气相色谱仪,（三）气相色谱法（,Gas chromatography, GC,）,1,、,GC,仪,载气：,H,2,、,N,2,、,He,进样系统：溶液直接进样或顶空进样,色谱柱：弹性石英毛细管柱,柱温箱 ：恒温和程序升温,检测器 ：,2,、,GC,仪组成,弹性石英毛细管柱,不锈钢填充柱,涂壁毛细管柱,载体涂层毛细管柱,2,、,GC,仪组成,色谱柱,检测器,火焰离子化检测器,(flame ionization detector , FID),热导检测器,(thermal conductivity detector, TCD),氮磷检测器,(nitrogen-phosphorus detector, NPD),火焰光度检测器,(flame photometric detector , FPD),电子捕获检测器,(electron capture detector , ECD),质谱检测器,(mass spectrometric detector, MSD),2,、,GC,仪组成,3,、,GC,定性方法,两个定性参数,:t,R,值、,MS,4,、,GC,定量方法,内标校正因子法,外标法,面积归一化法,标准溶液加入法,中国药典,(2010,年版,),气相色谱法用于中药分析的品种有,50,余种。,5,、,GC,法的应用,Pogostemon cablin,中,patchouli alcohol,、,pogostone,的测定,高效毛细管电泳,(high performance capillary electrophoresis, HPCE),毛细管电色谱,(capillary electrochromatography,，,CEC,）,液相色谱与核磁共振联用,(,LC-NMR,),LC/NMR/MS,（四）其他色谱法（,Miscellaneous chromatography,）,HPCE,HPLC-MS,三、定量分析方法的方法学验证,(,Validation of the analytical method,),目的：,证明采用的分析方法适合于相应检 测要求。,方法验证用于：,建立新的分析方法时,原分析方法进行修订时,(,一,),验证内容,线性及范围（,linearity and range,）,准确度,(accuracy),专属性（,specificity,）,精密度（,precision,）,重复性（,repeatability,）,重现性（,reproducibility,）,检测限及定量限（,limit of detection and quantification,）,耐用性,(robustness),1,、线性（,linearity,）和范围（,range,）,线性,是指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物质浓度直接呈正比关系的程度。,范围,系指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。,(,二,),实验设计,线性（,linearity,）和范围（,range,）,Analytes t,R,Calibration curve,r,2,test range,m,g/ml,线性（,linearity,）和范围（,range,）,2,、准确度,(accuracy),准确度,系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率,(,),表示 ；,回收率,% =,（实测值,-,供试品所含被测成分量）,/,加入对照品量,对照品,药材量,（,g,）,药材中对照品含量,(mg),加入量,(mg),测得总量,(mg),回收率,(%),平均回收率,(%),RSD(%),贝母素乙,1.0055,0.6787,0.6640,1.3253,97.4,100.4,2.94,1.0004,0.6753,0.6640,1.3439,1.0002,0.6751,0.6640,1.3574,1.0005,0.6753,0.6640,1.3389,1.0006,0.6754,0.6640,1.3204,97.1,1.0002,0.6751,0.6640,1.3698,104.6,准确度,(accuracy)-,加样回收率,100.7,102.8,99.9,对照品,药材量,（,g,）,药材中对照品含量,(mg),加入量,(mg),测得总量,(mg),回收率,(%),平均回收率,(%),RSD(%),丹酚酸,B,0.1501,8.72,高,9.97,18.88,101.9,100.92.6,2.6,0.1500,8.72,10.01,18.98,102.5,0.1502,8.73,10.05,18.92,101.4,0.1499,8.71,中,17.53,101.8,0.1501,8.72,17.60,102.6,0.1503,8.74,17.63,100.0,0.1498,8.71,低,6.97,15.98,104.3,0.1501,8.72,6.56,15.14,97.8,0.1499,8.71,6.67,15.10,95.7,准确度,(accuracy)-,加样回收率,8.66,8.65,8.89,3,、专属性,（,specificity,）,专属性,系指在其他成分可能存在时，采用的方法能正确测定出被测物的特性。,专属性常用的试验方法,:,空白阴性对照试验,比较同一分析系统对照品与供试品相应色谱,峰的吸收光谱,色谱,-,质谱联用验证待测成分,忍冬苷,木犀草苷,芦丁,金丝桃苷,木犀草苷,忍冬苷,金丝桃苷,芦丁,2005,年版中国药典分离条件下木犀草苷与忍冬苷共流出,对照品,对照品,金银花中忍冬苷（,MW594),和木犀草苷,(MW448),提取离子流图,忍冬苷,木犀草苷,MW594,MW448,新方法,(2010,年版中国药典,),对照品的分离图,芦丁,金丝桃苷,绿原酸,忍冬苷,木犀草苷,对照品,样品,UV,MS,UV,MS,采用,HPLC-DAD-MS,联用技术，,测定待测色谱峰的紫外吸收光谱及质谱来判断色谱峰的纯度，确保分析方法的专属性。,4,、精密度（,precision,）,精密度,是指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间接近的程度。精密度通常包括以下三个方面的含义：,重复性,(repeatability) :,批内精密度（,intra-assay precision,）,中间精密度,(intermediate precision),重现性,(reproducibility),中间精密度表示方法,日内精密度,(intra-day variability),日间精密度,(inter-day variability),浓度,日内精密度（,n=6),日间精密度（,n=3),峰面积（,X,）,XSD,RSD(%),峰面积（,X,）,XSD,RSD(%),137,m,g/mL,6265.0,6373.375,1.2,6351.8,6351.368,1.1,6299.7,6385.3,6282.4,6400.9,6431.3,6419.7,6457.6,27.4,m,g/mL,1315.8,1302.313,1.0,1294.8,1322.631,2.4,1317.2,1284.0,1316.5,1291.4,1299.4,1356.6,1305.8,13.7,m,g/mL,489.3,493.53.8,0.76,490.0,498.614,2.9,490.5,493.3,490.6,497.4,498.7,515.2,492.0,重复性,（,repeatability,）,重复性,是指在同一条件下对同一批样品，从样品供试品制备开始，制备至少六份以上供试品溶液,(,即,n6),，或设计,3,个不同浓度，每个浓度各分别制备,3,份供试溶液，进行测定，计算其含量的平均值和相对标准偏差,(RSD),。,样品质量,(g),丹酚酸,B,（）,丹参酮,A,（）,高,0.5005,5.74850.0325,0.45400.0023,0.5004,5.65140.0643,0.45940.0021,0.4999,5.77630.0082,0.45290.0007,中,0.3003,5.86470.0135,0.45750.0011,0.3003,5.71120.0353,0.45390.0029,0.3006,5.69470.0232,0.44300.0021,低,0.1999,5.86180.0704,0.47510.0023,0.2005,6.02390.0117,0.44890.0029,0.2001,5.98380.0509,0.45020.0096,平均值,SD(%),5.81290.1298,0.45500.0090,RSD(%),2.2,2.0,重现性,（,reproducibility,）,重现性,是指在不同的实验室由不同分析人员测定结果的精密度。当分析方法将被法定标准采用时应进行重现性实验。,3,批月季花样品中金丝桃苷、异槲皮苷的含量,样品,来源,中国药科大学结果,江苏省药检所结果,相对偏差（,%,）,金丝桃苷,(%),异槲皮苷,(%),金丝桃苷,(%),异槲皮苷,(%),金丝桃苷,(%),异槲皮苷,(%),YJH-1,福建漳州,0.2434,0.2203,0.2552,0.2316,2.4,2.5,YJH-3,安徽亳州,0.2478,0.2433,0.2549,0.2577,1.4,2.9,YJH-7,陕西宝鸡,0.2445,0.2414,0.2618,0.2539,3.4,2.5,表明方法重现性良好！,5,、检测限及定量限,（,limit of detection and quantification),检测限,是指试样中被测物质能被检测出的最低浓度或量。,定量限,是指样品中被测物质能被定量测定的最低量。,丹酚酸,B,丹参酮,A,峰面积,1,6.6,5.9,峰面积,2,6.5,5.9,峰面积,3,6.6,5.7,峰面积,4,6.5,6.0,峰面积,5,6.4,5.8,RSD,1.3,1.9,LOQ,（,ng,）,9.00,1.37,LOD,（,ng,）,4.50,0.342,6,、耐用性,(robustness),耐用性,系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为使方法用于常规检验提供依据。,HPLC,变动因素有：,GC,变动因素有：,TLC,变动因素有：,1,2,Diamonsil-C18 (5,m, 4.6mm250mm),不同色谱柱,Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18 (5,m, 4.6mm250mm),不同色谱柱,7,、系统适用性试验,(system suitability),对分析设备、电子仪器与实验操作、被测试样品等一起作为完整的系统进行评估，确保系统在样品分析的时候能很好地运行。其参数的设置需根据被验证方法的类型而定。,