生物制药酶类药物解读

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生物制药酶类药物解读,生物制药酶类药物解读生物制药酶类药物解读,超氧化物歧化酶是一种重要的氧自由基清除剂，作为药用酶在美国、德国、澳大利亚等国已有产品。由于,SOD,能专一性去除超氧阴离子自由基，故引起国内外生化界和医药界的极大关注。,目前临床上应用集中在自身免疫性疾病上如类风湿关节炎，红斑性狼疮，皮肌炎等,三、超氧化物歧化酶（,Superoxide dismutase, SOD）,稳定性,对热稳定：天然牛血,SOD,可,75,加热数分钟，对热稳定性与溶液离子强度有关,对,pH,的稳定性：一般,pH5.39.5,较稳定，猪血,SOD,在,pH7.6,9,较稳定,。,吸收光谱,1.SOD,的性质,结构特点：,金属酶,Fe-SOD:,Mw38000,，,2,个亚基，每个亚基含,1,个,Fe,，存在,于 中,Cu,、,Zn-SOD:,Mw32000,，,2,个亚基，每个亚基含,1,个,Cu,，,1,个,Zn,，存在于 中,Mn-SOD:,原核细胞中，,Mw40000,2,个亚基，每个亚基,1,个,Mn,真核细胞中，,Mw80000,，,4,个亚基，每个亚基,1,个,Mn,真核细胞,原核细胞,金属辅基与酶活性关系,Cu,、,Zn-SOD,：,Zn,与分子结构有关，与催化活性无关,;Cu,与活性有关，对酶活力是必需的,Mn-SOD,：,Mn,对酶活力是必需的,Fe-SOD,：,Fe,对酶活力是必需的,2.,生产工艺,分离纯化,SOD,常根据原料，种类和性质的差异而有所不同。,（1）以牛血红细胞提取,Cu、Zn-SOD,的工艺,（,2,）工艺过程：,1,）收集、浮选 取新鲜牛血，离心除去血浆。,2,）溶血、去血红蛋白：干净红细胞加水溶血,30min,，然后加入,0.25,倍体积的乙醇和,0.15,倍体积的氯仿，搅拌,15min,，离心去血红蛋白，收集上清液。,3,）沉淀、热变性：将上述清液加入,1.2,1.5,倍体积的丙酮，产生大量絮状的沉淀，离心得沉淀物。再将沉淀物加适量水，离心去不溶物，上清液于,60,70,热处理,10,分钟，离心去沉淀得浅绿色得澄清液。,4,）柱层析、洗脱、超滤浓缩：将上述澄清液超滤浓缩后小心加到已用,2.5mmol/L,，,pH7.6,磷酸缓冲液平衡好的,DEAE,sephadex A50,柱上吸附，并用,pH7.6,的,2.5,50mmol/L,的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集具有,SOD,活性的洗脱液。,5,）冷冻干燥,（2）以牛肝为原料提取,Mn-SOD,的工艺,二、胃蛋白酶（,Pepsin,）,胃蛋白酶：是一种消化性蛋白酶，由胃部中的胃粘膜主细胞（,gastricchiefcell,）所分泌，功能是将食物中的,蛋白质分解,为小的肽片段。,胃蛋白酶也是第一个从动物身上获得的酶。,自猪、牛、羊等胃粘膜提取的胃蛋白酶用作助消化药。常与稀盐酸同时用于幼畜消化不良性腹泻和慢性萎缩性胃炎。,临床上主要用于因食蛋白过多，引起的消化不良及病后恢复期消化机能减退等。,1,、组成（结构）、性质,胃中惟一的一种蛋白水解酶。其最适,pH,值为,1,2,。,胃蛋白酶作用的主要部位是芳香族氨基酸或酸性氨基酸的氨基所组成的肽键。,药用胃蛋白酶是胃液中多种蛋白水解酶的混合物，含有胃蛋白酶，组织蛋白酶，胶原酶等，为粗制的酶制剂。,性状：外观为淡黄色粉末,2,、生产工艺,（,1,）工艺路线：,猪胃粘膜,自溶液,上清液,成品,自溶，过滤,H,2,O, HCl,氯仿,脱脂,浓缩干燥,（,2,）工艺过程：,自溶、过滤,在夹层锅内预先加水,100L,及盐酸，加热至,50,时，加入,200kg,猪胃粘膜，快速搅拌使酸度均匀，保持,4548,消化,34,小时。用纱布滤去未消化的组织蛋白，收集滤液。,脱脂、去杂质,将滤液降温至,30,以下，静防,2448h,，使杂质沉淀除去，得到脱脂酶液。,浓缩干燥,取脱脂酶液，在,40,以下浓缩到原体积的,1/4,，真空干燥，球磨，得到产品。,三、尿激酶（,Urokinase,）,尿激酶是一种碱性蛋白酶，由肾脏产生，主要存 在于人和哺乳动物的尿中。人尿平均含有,56U/ml,。,临床上，尿激酶已经广泛应用于治疗各种新血栓形成或血栓梗塞疾病。,1.,组成性质,（,1,）尿激酶有多种分子量形式，主要有,31300,、,54700,两种。尿中的尿胃蛋白酶原在酸性条件下可以激活生成尿胃蛋白酶，后者可以把分子量,54700,的天然尿激酶降解为分子量为,31300,尿激酶。,（,2,）尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶，血纤维蛋白溶 酶原是它唯一的天然蛋白质底物，它作用于精氨酸缬氨酸键使得纤溶酶原转为纤溶酶。,（,3,）尿激酶的,pI,为,pH8-9.,2.,生产工艺,(1),工艺路线：,男性尿液,10pH8.5,上清尿液,沉淀,pH55.5,酸化,酸化尿,硅藻土吸附,硅藻土吸附物,洗涤,硅藻土柱,洗脱,洗脱液,去热原，去色素,pH8.0,流出液,CM,C,柱,洗脱液,透析液,产品,（,2,）工艺过程：,收尿 收集男性尿,沉淀处理 尿液冷至,10,以下，用,NaOH,调,pH,至,8.5,静置,1h,，虹吸上清液。用盐酸调至,pH5.05.5,。,硅藻土吸附 处理好的尿液加入,1%,尿量的硅藻土，于,5C,下搅拌吸附,1h,。,洗脱 硅藻土吸附物洗涤装柱，先用,0.02%,氨水加,0.1mol/L,氯化钠洗脱，当洗脱液油清变混时开始收集,除热源、去色素,CM,C,浓缩,透析除盐,四、,L-,天门冬酰胺酶（,L-asparaginase,）,天门冬酰胺酶是酰胺基水解酶，为抗肿瘤酶制剂。肿瘤细胞不能合成生长必需的天门冬酰胺而使其生长受到限制。正常细胞能合成天门冬酰胺，故受影响较少。因此，天门冬酰胺酶是一种对肿瘤细胞有选择性的抑制药物。,L-,天门冬酰胺酶为白色结晶粉末，微有湿性，易溶于水，不溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙醛、苯等有机溶剂。对热稳定性好，在温度,50,下，,15min,后，活性降低,30%,，,60,下，,1,小时内失活。,工艺路线：,大肠杆菌,肉汤培养基,37,48h,肉汤菌种,玉米浆,37,48h,种子菌种,玉米浆,发酵液,丙酮,干菌体,硼酸缓冲液,提取液,HAc,干粗酶,甘氨酸,酶溶液,PEG,无热原酶液,无菌分装,L-,天冬酰胺酶冻干制剂,37,68h,pH8.3,48h,pH4.24.4,60,30min,不同,pH,处理,菌种培养,种子培养,压滤,风干,提取,工艺过程：,菌种培养 大肠杆菌37培养24,h,普通牛肉培养基,;,种子培养 16玉米浆，接种量 1 1.5，37，通气搅拌培养 48,h;,发酵罐培养 玉米浆培养基，接种量 8，37通气搅拌培养 6 8,h，,离心分离发酵液，得菌体，加2倍量丙酮搅拌，压滤，滤饼过筛，自然风干成菌体干粉,.,提取、沉淀、热处理每千克菌体干粉加入0.01,mol/LpH8,的硼酸缓冲液10,L37,搅拌1.5,h,，308,mol/L,醋酸调节,pH4.24.4,，压滤，滤液加入2倍体积的丙酮，放置34,h,过滤，收集沉淀，自然风干，得干粗酶,.,取粗制酶，加入03甘氨酸，调节,pH8.8,搅拌1.5,h,离心，上清液6030,min,热处理。上清液加 2倍体积的丙酮，析出沉淀，离心，收集酶沉淀，0.01,mol/L，pH8,磷酸缓冲液溶解，离心得上清酶溶液,.,精制、冻干 调节,pH8.8,离心弃去沉淀，清液再调,pH7.7,加入50聚乙二醇，浓度达到 16。2 5放置 4 5天，离心得沉淀。蒸馏水溶解加 4倍量的丙酮沉淀，同法反复 1次，,pH6.4,0.05mol/L,磷酸缓冲液溶解，50聚乙二醇处理 1次，即得无热原的,L,一天门冬酸胺酶。溶于 0.8,mol/L,磷酸缓冲液，在无菌条件下用 6号垂熔漏斗过滤，分装，冷冻干燥制得注射用,L,一天门冬酸胺酶成品，每,I,支 1万或 2万单位。,五、,细胞色素,C,（,Cytochrome C,）,细胞色素：来自三羧酸循环中产生的琥珀酸辅酶,A,，其肽链仅有,104,个氨基酸，体内大量存在，一般无需外源补充；且外源补充与体内含量相比甚微。细胞色素,C,是生物氧化的一个非常重要的电子传递体，在线粒体崤上与其它氧化酶排列成,呼吸链,，参与细胞呼吸过程。,细胞色素,C,是中枢兴奋药，用于急救或辅助治疗各种原因引起的组织缺氧，如一氧化碳中毒，安眠药中毒、高山缺氧等，亦可用于脑缺氧、心肌炎、心肌代偿不全、心绞痛、心肌梗塞、肝炎、肾炎等。,细胞色素种类较多，可以用光谱学、血红素基团的精确结构、抑制剂的敏感度以及还原电势的大小来分辨。,根据辅基的不同，可以将细胞色素大致分为三类：,细胞色素,a,血红素,a,（原,血红素,）,细胞色素,b,血红素,b,（甲酰血红素）,细胞色素,d,二氢卟酚（,Chlorin,）的,衍生物,细胞色素,c,：与其他三类细胞色素非共价结合血红素不同的是，细胞色素,c,通过分子中的半胱氨酸巯基与血红素共价结合。,工艺路线：,新鲜猪心,绞碎,心肌碎肉,H2SO4,pH4,提取液,氨水,人造沸石,吸附物,25%(NH4)2SO4,洗脱液,(NH4)2SO4,滤液,浓缩,沉淀物,透析,粗品溶液,吸附,吸附物,洗脱,洗脱液,pH7.5,比重,1.211.23,CCL3COOH,蒸馏水,Amberlite IRC-50,原料处理,提取,压滤,中和,吸附,盐析,洗脱,NaHPO4-NaCl,精品溶液,蒸馏水,pH6.4,透析,成品,双甘肽,NaHSO4,制剂,工艺过程：,绞碎、提取、压滤,取新鲜或冷冻猪心，去血块、脂肪和肌健等，绞肉机中绞碎。称取心肌碎肉，加1,.5,倍量蒸馏水搅拌均匀，用硫酸调,pH,4左右，常温搅拌提取压滤，滤液用氨水调节,pH6.2，,离心得提取液。心渣再加等量蒸馏水同上法重复提取1次，合并两次提取液。,中和、吸附、洗脱,提取液加氨水中和至,pH7.5，,在冰箱中静止沉淀杂蛋白，吸取上层清液，每升提取液加入10,g,人造沸石，搅拌吸附40,min，,静置倾去上层清液。收集吸附细胞色素,C,的人造沸石，用蒸馏水和氯化钠溶液反复洗涤，然后装柱，用 25硫酸氨溶液洗脱，得洗脱液。,盐析、浓缩、透析,洗脱液加入固体硫酸镀达到 45饱和度，使杂蛋白析出，过滤。收集透明滤液，缓缓加入 20三氯醋酸，边加边搅拌使细胞色素,C,沉淀析出，离心收集沉淀。再将沉淀溶于蒸馏水，装入透析袋中，透析至无硫酸根为止，过滤得细胞色素,C,粗品溶液。,吸附、洗脱、透析,粗品溶液通过处理好的,Amberite IRC50（NH,4,）,树脂柱吸附，然后将树脂移入大烧杯中，水洗至澄清为止，再分别上柱，用06,mol/L,磷酸氢二钠与0.4,mol /L,氯化钠混合液洗脱，洗脱液用蒸馏水透析去氯离子，得细胞色素,C,精品溶液。,制剂,取含相当于1.5,g,的细胞色素,C,精品液，加200,mg,亚硫酸氢钠，搅拌溶解再加双甘肽1.5,g,混合均匀，用氢氧化钠调节,pH6.4,左右，加注射用水100,ml，,过滤除热原，6号垂溶漏斗过滤，测含量，灌注，冷冻干燥，即得每支含15,mg,细胞色素,C,的制剂。,习 题,1.,酶成为药物应具备的条件？,2.,微生物发酵法生产酶类药物，优良菌种获取的途径有哪些？,3.,在酶类药物制备过程中，如何保护酶活性？,4,生物提取法制备酶类药物时，在原材料的选择方面，要注意哪些方面？在原材料的预处理方面，有哪些方法？,5,微生物发酵法生产酶类药物时，如何进行发酵液的预处理？对胞内酶，有哪些细胞破碎方法？,6,试画出,L-,天门冬酰氨酶的生产工艺流程，并说明工艺控制要点。,谢谢大家！,结 语,