动物细胞工程

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,动物细胞工程,二、植物体细胞杂交,1,、在植物体细胞杂交实验中所用的技术手段有哪些？其理论基础是？,2,、如何去除植物细胞的细胞壁？,3,、人工诱导原生质体融合的方法？,4,、原生质体融合成功的标志是？,5,、植物体细胞杂交技术的意义,?,6,、植物细胞工程应用于哪些方面？,克服远缘杂交不亲和的障碍,植物细胞融合，植物组织培养,细胞膜的流动性，细胞全能性,24,日下午，中国科学院神经科学研究所的孙强团队宣布，,成功克隆出了两只食蟹猴,。这是世界,首个体细胞克隆猴,。,人类首次通过体细胞核移植的方式克隆出来的灵长类动物。,克隆猴的到来,给未来更多可能性,从落后到并跑，如今领先世界,而我们，有幸见证了一个伟大时代的开始，更可以期待一个更加美好的未来。,常用的技术手段：,动物细胞培养,动物细胞核移植,动物细胞融合,单克隆抗体的制备,2.2,动物细胞工程,（基础）,1.,动物细胞培养的概念,从动物机体内取出相关组织，将它分散成单个细胞，放在适宜的培养液中，让这些细胞生长和增殖。,2.,动物细胞培养的原理：,一、动物细胞培养,3.,培养过程（理解细胞贴壁、接触抑制、原代培养、传代培养新概念）,细胞的增殖,细胞贴壁,:,悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上。培养贴附性细胞时,细胞要能贴附于底物上才能生长繁殖,.,细胞接触抑制,细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，最后形成一个单层，此时细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止，数量不再增加。,取材,细胞悬液,10,代细胞,50,代细胞,传代培养,无限传代,单个细胞,加培养液,（可用胃蛋白酶吗？）,原代培养,胰蛋白酶或胶原蛋白酶,剪碎,过程：,动物组织细胞间隙中含有一定量蛋白质,重新用胰蛋白酶处理贴壁细胞,（动物胚胎或幼龄动物的组织、器官）,从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。,将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养,使细胞充分接触培养液，更容易进行物质交换,4.,动物细胞培养的条件,无菌、无毒的环境,培养液、用具无菌处理；培养液中加抗生素；,定期更换培养液（防止细胞代谢产物积累对细胞的毒害）,营养,培养液：水、无机盐、葡萄糖、氨基酸、微量元素、维生素、促生长因子、动物血清（血浆）,适宜的温度和,pH,哺乳动物：,气体环境（,95%,空气,+5%CO,2,）,O,2,：有氧呼吸等细胞代谢必需的,CO,2,:,维持培养液的,pH,与植物组织培养中所用培养基的区别？,补充合成培养基中所缺的成分，如生长因子,（,1,）生产蛋白质生物制品：,病毒疫苗、干,扰素、单克隆抗体等,（,2,）基因工程受体细胞的培养,（,3,）用于检测有毒物质（根据变异率）,（,4,）用于生理、病理、药理等方面的研究,（,5,）,培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植,动物细胞培养的应用,1.,动物核移植的概念：,将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。,2,、原理：,动物细胞的细胞核具有全能性。,用核移植方法得到的动物称为克隆动物。,胚胎细胞核移植、体细胞核移植,3,、过程：,电激处理使供体核进入受体卵母细胞构建重组胚胎,卵母细胞采集、培养,M,期,卵母细胞,供体牛,供体细胞注入去核卵母细胞,代孕母牛,克隆牛,体细胞培养,去核卵母细胞,去核,胚胎,移植,体细胞核移植过程（体细胞克隆动物）,1,、受体细胞为减数第二次分裂中期的卵母细胞的 原因？,卵母细胞比较大，易操作；细胞质中含有使体细胞核全能性表达出来的物质,3,、克隆过程运用的技术手段？,动物体细胞核移植、动物细胞培养、胚胎移植,4,、克隆牛的大部分性状与谁一样？完全一样吗？,供体牛,5,、此技术的繁殖方式属于？,无性繁殖,2,、供体牛一般选传代,10,代以内的细胞，为什么？,保证正常的二倍体核型，以保证供体细胞正常的遗传基础,细胞质中的遗传物质；环境,体细胞核移植技术的应用前景,1.,加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育,2.,保护濒危物种,3,.,转基因克隆动物作为生物反应器，产医用蛋白,4,.,用于组织器官的移植,5.,了解胚胎发育及衰老过程,6.,用,克隆动物做疾病模型，追踪研究疾病发展过程，治疗疾病,体细胞核移植技术存在的问题,1.,成功率非常低,2.,绝大多数克隆动物还存在健康问题，如体型过大，异常肥胖，发育困难，免疫失调等,3,、克隆动物食品的安全性问题,动物细胞培养,植物组织培养,植物细胞的全能性,细胞株、细胞系,植物体或组织,获得细胞,或细胞分泌蛋白,快速繁殖、培育无病毒植株等,葡萄糖、动物血清,蔗糖、植物激素,液体培养基,固体培养基,细胞增殖,培养结果,培养目的,培养基特有成分,培养基性质,原理,回顾一动物细胞培养,1,、动物细胞培养的原理是动物细胞的全能性（ ）,2,、简述动物细胞培养的过程？,2,、培养动物细胞时，需要使用两次胰蛋白酶，这两次的作用分别是？,3,、原代培养的细胞是指从贴壁生长到发生接触抑制的细胞（ ）区分原代培养和传代培养,4,、动物细胞培养一般能够传到,4050,代，但其遗传物质发生了改变（ ）,5,、为了防止培养过程中发生微生物污染，应将培养箱抽成真空以消毒灭菌（ ）,6,、动物培养基与植物培养基的区别？,错,错,错,错,细胞增殖,怎样保证无菌无毒的环境？,2,、受体细胞为减数第二次分裂中期的卵母细胞的 原因？,卵母细胞比较大，易操作；细胞质中含有使体细胞核全能性表达出来的物质,3,、克隆过程运用的技术手段？,动物细胞培养、动物体细胞核移植、胚胎移植,4,、克隆牛的大部分性状与谁一样？完全一样吗？,供体牛,5,、此技术的繁殖方式属于？,无性繁殖,细胞质中的遗传物质；环境,1,、简述动物体细胞核移植技术的原理及过程？,回顾二动物体细胞核移植技术,三、动物细胞融合,1.,概念：,2,、原理：,3,、诱导因素：,动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞融合形成一个细胞的过程。,融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。,细胞膜的流动性,聚乙二醇、灭活的病毒或离心、振动、电激等,仙台病毒,紫外线,灭活,丧失感染活性（不感染细胞）,保留融合活性（诱导细胞融合）,什么是,病毒的灭活？,灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。,灭活病毒诱导细胞融合的原理,病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。,4,、过程,把两个不同的动物细胞放在一起，用灭活的病毒处理细胞，它们先发生质融合，再出现核融合，进而形成杂交细胞。,融合完成的标志：,融合成功的标志：,两个或多个细胞核融合为一个细胞核。,杂交细胞进行有丝分裂,植物体细胞杂交与动物细胞融合的主要区别？,5.,意义：,突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。,6.,应用：,最重要的用途是,制备单克隆抗体,思考,？,1.,抗体由何种细胞产生？,如何产生？,2.,抗体,的化学本质是什么？,与抗原作用的特点？,主要分布在哪里？,3.,用传统的方法如何获得抗体？,四、单克隆抗体,科勒,米尔斯坦,荣获,1984,年诺贝尔生理学或医学奖,如果把一种,B,淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞进行融合，所得到的融合细胞既能大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体。,（二）单克隆抗体的制备,单克隆,抗体,:,单个细胞克隆产生的化学,性质单一、特异性强的抗体,利用浆细胞产生抗体的功能,利用肿瘤细胞无限增殖的特性,利用细胞融合技术将两种细胞融合获得杂交瘤细胞,利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞,设计方案：,骨髓瘤细胞,免疫小鼠,单克隆抗体,筛选,克隆、筛选,体内培养,体外培养,B,淋巴细胞,（选择培养基）,（抗体检测）,细胞融合,杂交细胞,1,、（只考虑两两融合）融合细胞几种类型？,2,、本过程中进行了两次筛选，目的分别是,什么？第,1,次筛选要淘汰哪些细胞？,思考以下问题：,有三种类型融合细胞,第一次筛选是为了得到杂交瘤细胞，淘汰掉,B,淋巴细胞与,B,淋巴细胞的融合类型及骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞的融合类型。,第二次筛选是进行抗体检测，为了得到能产生单一抗体的杂交瘤细胞。,动物细胞融合：,1,、动物细胞融合的原理：,动物细胞融合技术常用的诱导方法,： 。,2,、植物体细胞杂交和动物细胞融合的主要区别？,单克隆抗体的制备：,1,、选取的细胞是：,2,、该过程共筛选了几次？目的各是？,3,、杂交瘤细胞的优点？,4,、单克隆抗体的优点？,特异性强、灵敏度高、并能大量制备,灭活的病毒、聚乙二醇、电激、离心、震动,效应,B,细胞、骨髓瘤细胞,既能大量繁殖，又能产生专一性抗体,细胞膜的流动性,第一次筛选杂交瘤细胞；第二次筛选能产生所需抗体的杂交瘤细胞,细胞合成,DNA,有,D,和,S,两条途径，其中,D,途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种,DNA,的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中只有,D,途径，没有,S,途径，能无限分裂增殖。,在培养液中加入氨基嘌呤后，使,D,合成途径阻断，仅有,D,合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞，因为可以利用淋巴细胞中的,S,途径合成,DNA,而增殖。,两次筛选的原理和方法是不相同的。,首先用选择培养基筛选出杂交瘤细胞,通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔细胞培养板上培养，使每孔细胞不超过一个，再由这些单细胞分裂增殖，,然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。,最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。,再筛选出,能分泌所需抗体的杂交瘤细胞,阳性孔,方法,抗原,-,抗体杂交法,3,、杂交瘤细胞有何特点？,4,、本过程利用的哪些技术？,5,、,单克隆抗体的优点是什么？,既能迅速大量增殖，又能产生单克隆抗体,动物细胞培养、动物细胞融合,特异性强、灵敏度高、可大量制备,（三）单克隆抗体的应用,（,1,）作为诊断试剂,最广泛应用,准确、高效、简易、快速,（如同位素标记单克隆抗体，可诊断肿瘤、心血管畸形等）,（,2,）用于治疗疾病和运载药物,生物导弹,=,单克隆抗体,+,药物，,治疗肿瘤）,(“,生物导弹”,单抗导向，药物为弹头,),1,、科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是（ ）,A.,经过免疫的,B,淋巴细胞,B.,没经过免疫的,T,淋巴细胞,C.,经过免疫的,T,淋巴细胞,D.,没经过免疫的淋巴细胞,A,巩固练习,巩固练习,2.,动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较中，正确的是（ ）,诱导融合的方法完全相同,B.,操作步骤基本相同,C.,所用的技术手段基本相同,D.,都能形成杂种细胞,D,3.,单克隆抗体制备过程中培育的杂交细胞是（ ）,A.,由小鼠能产生抗体的,B,淋巴细胞与肝细胞融合,B.,由小鼠一个,B,淋巴细胞诱导融合而成,C.,由小鼠一个,B,淋巴细胞与肌瘤细胞诱导融合而成,D.,由小鼠一个,B,淋巴细胞与骨髓瘤细胞诱导融合而成,D,4.,只能使动物细胞融合的常用诱导方法是（ ）,A,PEG,B,灭活的病毒,C,电刺激,D,离心,B,5.“,生物导弹”是指 （ ）,A.,单克隆抗体,B.,杂交瘤细胞,C.,产生特定抗体的,B,淋巴细胞,D.,在单克隆抗体上连接抗癌药物,D,The End,谢谢您的聆听！,期待您的指正！,