二乙酰一肟检测尿素

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,尿素的测定,1,简 介,尿素又称脲，是体内蛋白质分解代谢的含氮终产物，不与血浆蛋白结合，分子量仅为60，体内生成量受蛋白质摄入量，机体蛋白质分解代谢及肝脏（生成尿素的唯一器官）功能的影响。,尿素是表明游泳池水受到人体污染程度的一项重要指标。,2,二乙酰一肟（diacetylmonoxime）,法检测尿素（urea）含量,原理,：,尿素与二乙酰在酸性环境中加热可缩合成红色的二嗪衍生物，颜色深浅与尿素含量成正比。因二乙酰不稳定，故通常用二乙酰一肟代替，它与强酸作用，产生二乙酰。后者再与尿素反应，缩合生成红色的二嗪衍生物。,3,临床二乙酰一肟法,H,+,二乙酰一肟,+水,二乙酰,+羟胺,H,+,二乙酰+尿素,二嗪化合物（粉红色）,4,泳池二乙酰一肟法,5,临床二乙酰一肟法测定尿素,1 原理,尿素与二乙酰一肟在酸性条件下，经镉离子（或三价铁离子）的催化产生缩合，并在氨基硫脲存在下，生成了4，5-二甲基-2-氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比。,6,2 试剂,2,1,酸性试剂：在 1 L容量瓶中加入蒸馏水约 100 mL，,然后加入浓硫酸 44 mL 及 85 %磷酸 66 mL，冷却至,室温后加入硫氨脲 80 mg，硫酸镉 2 g，溶解后用蒸馏,水稀释至 1 000 mL，贮棕色瓶中放冰箱内保存半年,不变。,22,2 %二乙酰一肟溶液：取 2 g 二乙酰肟，溶于蒸馏,水中，定容 100 mL混合均匀，即可使用。,尿素使用液：取酸性试剂 90 mL加 2 %二乙酰一,肟 10 mL，混合均匀即可。,7,3 方法,3,1,定性测定：取使用液 2 mL 加入试管中，加 0.1 mL,牛奶，在电炉上快速加热至煮沸，保持沸腾 1 min，观察,颜色，用不含尿素样品做比较。正常奶颜色为淡红色，,添加尿素的牛奶反应颜色为玫红色。,3,2,定量测定：取5mL使用液加入0.1mL牛奶，于20 mL,的螺口试管中，加盖拧紧，于 95 水浴中反应 20 min，过,滤后，于 525 nm处测定吸光值。,8,4 结果,由于正常牛奶中含有少量的尿素，所以正常牛奶的反应试管也是有颜色的，由于尿素含量较少，所以颜色为淡红色。尿素含量异常的牛奶，反应后颜色为玫红色。两者的区别明显，在实际的质量控制中，应以正常奶做比较，来判断原料奶中尿素含量的水平，进而做出判断。,9,5 小结,优点：灵敏度高，操作简单，适用于自动仪器分析。,缺点：反应不专一，线性范围窄（150mmol/L),特异性低，试剂腐蚀性强，加热有异味释放。难以实现自动化。,10,游泳池水中二乙酰一肟的检测方法,常采用卫生部颁发的二乙酰一肟分光光度法(简称原法) 。,11,二乙酰一肟分光光度法（国标法）,1,.,原理,尿素与二乙酰一肟及安替比林反应呈现黄色, 在波长460 nm 处有最大吸收峰,与标准系列比较定量。,12,2,试剂,2,1,二乙酰一肟溶液(2 g/L) : 取,0,2g,二乙酰一肟,CH3COC (NOH) CH3 溶于10% 乙酸中,并稀释至100 ml,保,存于棕色瓶中。,2,2,安替比林溶液(2 g/L) :取,0,2g,安替比林C6H5NN,(CH3 )C(CH3 )CHCO溶于1 + 1硫酸中并稀释至100 ml,保,存于棕色瓶中。,2,3,尿素标准储备溶液(100g/ml)和尿素标准使用溶液,(10g/ml) 。,2,4,仪器和器材,UV - 2102C型分光光度计、沸水浴锅、25 ml棕色具塞比,色管(粗细、玻璃厚薄均匀一致) 。,13,3,分析步骤,3,1,吸取水样,10ml,（尿素含量在,0,001,0,015mg,范围内）于,25ml,棕色具塞试管中，另取棕色具塞试管加入尿素标准使用液,0,、,0,1,、,0,3,、,0,5,、,0,7,、,0,9,、,1,1,、,1,3,、,1,5ml,，并用纯水稀释至,25ml,。（注：显色后溶液遇光退色，故需用标色法）。,3,2,于上述各管加入,1,0ml,二乙酰,肟溶液，混均。再加安替比林溶液,2,0ml,，混匀。,3,3,将上述试管在沸水浴中加热,50min,。取出并在流动的自来水中冷却,2min,。立即以纯水为对照，在,460nm,处，用,1cm,比色皿，测定各管吸光值（加热,45,55min,，呈最深色，若再延长时间吸光值下降）。,34,以浓度对照吸光值，制备标准曲线。以水样吸光值从曲线上查出尿素含量。,14,4 小结,优点：操作简便、灵敏度高。,缺点：线性范围窄、反应时间长、标准曲线相关系数难以达到0,.,1999以上，对于尿素浓度高的水样,虽可将水样稀释后进行测定,但稀释倍数难以估计, 所以需反复重测 , 既费时,又浪费试剂。,15,二乙酰一肟分光光度法（改进）,16,1,原理,目前二乙酰一肟,-,安替比林分光光度计, 1,是测定尿素的唯一标准方法,该法存在标准曲线线性范围较窄,( 011 11 5 m g /L),吸光度偏低,反应产物不稳定,溶液显色后遇光褪色等多种问题,对检测结果影响较大,为此本法参阅有关文献, 2, 3 ,通过摸索,将国标法中的标准曲线扩大,定容体积由,25 m l,改为,10 ml,使线性范围变宽,吸光度的值增大,标准系列的稳定时间长,结果满意,其准确度、精密度较好,能满足基层实验室的需要。,17,2,试剂,2,1 0,2,二乙酰一肟溶液：称取,0,2g,二乙酰一肟,CH,3,COC,：（,NOH,）,CH,3,溶于,10,乙酸中，并稀释至,100ml,，保存于棕色瓶备用。,2,2 0,2,安替比林溶液：称取,0,2g,安替经林（,1,，,5,二甲基,2,苯,3,吡唑酮,C,6,H,5,NN,（,CH,3,）,C,（,CH,3,）：,CHC,：,O,），溶于,1,1,硫酸中并用混酸稀释至,100ml,，棕色瓶中保存。（注：硫酸浓度大于,1,1,时，显色缓慢且操作不便。）,2,3,尿素标准溶液：准确称取,0,1000g,尿素于小烧杯中，加少量纯水溶解后转入,1000ml,容量瓶中，加,0,1ml,氯仿并用纯水定容，此液每,ml,含,0,1mg,尿素。冷藏保存。,2,4,尿素标准使用溶液，准确吸取尿素标准储备溶液,10,00ml,于,100ml,容量瓶中，用纯水定容，此液每,ml,含,0,01mg,尿素。,18,3,分析步骤,3,1,取游泳池水样10 ml于25 ml比色管中。另取尿素标准使用溶液( 10g/ml) 0、,0,25、0,50、1,00、2,00、3,00、4,00、5,00、6,00 ml (尿素含量为0、2,5、5、10、20、30、40、50、60g) ,各管加纯水至10 ml,做标准系列。,3,2,样品及标准系列管各加入110 ml二乙酰一肟溶液,摇匀,再加入210 ml安替比林溶液,混匀后置沸水浴锅中煮沸20 min (建议同时放入同时取出,或按次序放入、取出,以保证加热时间的一致。在样品多时这点尤为重要) ,在沸水浴时轻轻盖上比色管塞,以防溶液蒸发。,3,3,停止加热后在冷水浴(1015,冷水浴水位高于比色管中溶液为佳) 中冷却2 min, 再次混匀后以纯水为对照, 在460 nm处,用1 cm 比色皿,在避免阳光直射的条件下测定吸光度。绘制标准曲线并求得样品中尿素的浓度。,19,4 小结,用改进后的二乙酰一肟比色定量法,标准曲线线性范围较原法有了很大提高,最高浓度可以测到610 mg/L,超过610 mg/L 的水样进行一倍稀释基本上均在标准曲线线性范围以内, 并保持原法的精密度与回收率; 煮沸时间由原来的50 min缩短至20 min,消除了由于长时间煮沸造成的各管溶液体积不一致、从而导致测定结果不准确的弊端;方法的精密度、准确度好,优于原法,且符合卫生检验的要求。,20,国标法改进前后对照表,21,二乙酰一肟-氨基硫脲（thiosemicarbazide）法,氨基硫脲,作用,酸性试剂中的氨基硫脲与硫酸镉可促进尿素与双乙酰结合，提高灵敏度和显色后的稳定性。,化学式,CH5N3S,结构式,H,2,N,N,H,C,II,S,NH,2,起主要作用,22,2（NH,2,),2,-C=O + 2（NH,2,),2,-C=S-（NH,2,),2,-C=C(NH,2,),2,+ SO,2,+ S,（尿素） （氨基硫脲）,反应关系式,23,1原理,尿素在氨基硫脲存在下，与二乙酰一肟在强酸环境中加热，生成红色的二嗪衍生物。显色强度在一定范围内与尿素含量成正比。,24,2,试剂,21,酸性试剂 浓硫酸,200ml,与磷酸,300ml,混匀，冷至室温。加 氨基硫脲,50mg,，硫酸镉,2.0g,溶解，棕色瓶冷藏至少可保存一年。,2,2,二乙酰一肟溶液 称取,4.0g,二乙酰一肟，溶解后加纯水至,200ml,，棕色瓶冷藏可保存半年。,2,3,尿素标准贮存液 准确称取,0.1000g,尿素，加少量纯水溶解 后，移至,1000ml,容量瓶中，加,5,滴三氯甲烷作防腐剂，用纯水定容至刻度。4保存，此溶液尿素浓度为0.1mg/ml。,24,尿素标准使用液 临用时将尿素标准贮存液稀释,10,倍。此溶液尿素浓度10ug/ml。,25,3,操作步骤,3,1,取水样,10ml,于具塞标准比色管中。另取比色管,8,只，分别加入,10ug/ml,的尿素标准使用液0、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00ml，各加水至约10ml。,32,每管各加酸性试剂,5.0ml,，,2%,的二乙酰一肟溶液,2.0ml,，加纯水至,25ml,。沸水浴12分钟，取出后用冷水冷却至室温。,3,3,以空白管调零，在,540nm,处，用,1cm,比色皿测定各管吸光值。以浓度对照吸光值，制备标准曲线。以水样的吸光值在标准曲线上查出尿素含量。,26,4 结果,本法操作简便，溶液显色稳定，线性范围宽，试剂稳定时间长，适合平时工作中使用。,27,作用,作显色稳定剂。,化学式,（,CH,3,）,2,CHOH,结构式,H,3,C,异丙醇,CH,CH,3,I,OH,二乙酰一肟-异丙醇-安替比林法,28,1,原理,在原发的基础上，选择异丙醇作显色稳定剂对游泳池水中尿素进行测定，使标准曲线的线性范围有了很大的提高，缩短了煮沸时间，方法的精密度、准确度优于原法，且符合卫生检验要求。,29,2 试剂,2.1,二乙酰一肟,-,异丙醇溶液 称取,1.0g,二乙酰一肟溶于,1+9,乙酸溶液中，并使其总量为,100ml,，于此溶液中加入异丙醇,50ml,，混匀，棕色瓶中保存。,2.2,安替比林溶液 称取,0.2g,安替比林溶于,1+1,硫酸中，并使其总量为,100ml,，棕色瓶中保存。,2.3,尿素标准贮备液 称取,0.1000g,尿素，溶于少量水后移入,1000ml,容量瓶中，加,0.1ml,氯仿并用水定容，冷藏保存，此液,1.00ml,含,0.100mg,尿素。,2.4,尿素标准使用液 吸取尿素标准贮备液,10.00ml,于,100ml,容量瓶中，以水定容，此液,1.00ml,含,10. 0ug,尿素。,2.5,实验用水均为去离子水。,30,3 测定步骤,3.1,吸取水样,10.0ml,于,25ml,无色具塞比色管中，另取同型比色管分别加入尿素标准使用液,0,、,0.20,、,0.50,、,1.00,、,2.00,、,3.00,、,4.00,、,5.00ml,，以水定容至,25ml,。,3.2,于上述各管中加入二乙酰一肟,-,异丙醇溶液,1.50ml,，混匀。再加入安替比林溶液,2.00ml,，混匀。,3.3,各管加塞后同时置沸水浴中加热,20min,，取出，在流动的自来水中冷却,2min,。以水为对照，于,460nm,处，用,1cm,比色皿测定各管吸光度。,3.4,计算标准系列直线回归方程，以水样吸光度代入方程，求出水样尿素含量。,31,4 小结,与标准方法比较，有遇光不退色，可用普通无色比色管操作；线性范围扩大，一般游泳池水样可不经稀释一次完成测定；沸水浴时间大大缩短，节约时间等优点。应用于游泳池水中尿素的测定，其重现性、回收率、与标准方法的对照试验，均获得满意结果。,32,临床与预防二乙酰一肟法的区别,34,3 讨论,3.1 尝试以异丙醇、异丁醇、正戊醇、丙酮、乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、甲醛、正辛醇、异戊醇等十余种有机溶剂作显色稳定剂试验，结果显示：甲醛使显色无法进行；正辛醇、异戊醇水溶性差，溶液出现混浊；其余试剂均有显色稳定作用，但以异丙醇显色后最稳定，灵敏度较高，水溶性好，且为常用试剂，无毒，易购得，故选之。异丙醇的使用，弥补了标准方法,3.2 经实验，异丙醇用量在,0.40.6ml/,管时，空白值较低，灵敏度较高，稳定性好，故选其中间值（,0.5ml/,管），按此比例将其与二乙酰一肟试剂混合后加入，操作方便，且不影响二乙酰一肟试剂的稳定性。,3.3 当二乙酰一肟溶液用量为,1ml/,管，其浓度为,10g/L,与,20g/L,时，灵敏度较高，且两者基本相同，而当其浓度为,2g/L,时，灵敏度大大降低，故选其浓度为,10g/L,。因其与异丙醇混合后一次加入，为达二物质最佳显色量，故该混合试剂加入量为,1.5ml,。,35,3.4 当安替比林溶液用量为,2ml/,管，浓度为,2g/L,与,10g/L,时，对测定基本无影响，故保持标准方法中该试剂,2g/L,的浓度。,3.5 实验表明，沸水浴时间从,1540min,，随加热时间的延长，吸光度增加，标准斜率加大，继续延长加热时间，则线性变差。加热,25min,时，,50ug,管吸光度近,0.8,，仪器测定误差加大，故本法选用沸水浴加热,20min,，比标准方法的沸水浴,50min,时间大大缩短。因沸水浴时间不同，吸光度差别较大，故水样应与标准系列同批测定。同时，沸水浴容量应较大，避免过挤致受热不匀，使反应不均匀、完全。,3.6 作标准系列及水样显色定容后立即至,26h,稳定性试验，实验结果显示：在显色定容后,2h,内呈色稳定，测定偏差小，比色测定最好在此期间完成。延长至,20h,间，吸光度值逐渐增大，但在此期间只要标准系列与水样为同批测定，对低、中浓度样品结果基本无影响，高浓度样品偏差稍大，但尚可接受（相对偏差,5%,）。若再延长时间则不可取。,3.7 游泳场所卫生标准（,GB9667-1996,）中规定尿素应,3.5mg/L,。本法线性范围包容了上述浓度，对一般水样可直接一次测定完成，避免了标准方法测定尿素浓度在,1.55mg/L,水样时，因超出线性范围需将样品稀释后重新测定的麻烦及引入的误差。,36,本法从十余种有机溶剂中筛选出异丙醇作显色稳定剂，并经反复实验研究，对游泳池水中尿素测定的标准方法作了改进。与标准方法比较，有遇光不退色，可用普通无色比色管操作；线性范围扩大，一般游泳池水样可不经稀释一次完成测定；沸水浴时间大大缩短，节约时间等优点。应用于游泳池水中尿素的测定，其重现性、回收率、与标准方法的对照试验，均获得满意结果。,37,自己的想法,38,化学性质：,红色粉末，微溶于水，溶于醇和稀酸。主要用于鉴定羰基化合物（,-CO,）。是易燃易爆品，需小心使用。,显色作用：,在酸性介质中，羰基化合物与,2,，,4-,二硝基苯肼（的甲醇,-,盐酸溶液）反应，生成,2,，,4-,二硝基苯腙，在碱性溶液中呈暗红色，可用于分光光度法 （,445nm,处测吸光度）或目视比色法测定羰基化合物。,关于,2,4-,二硝基苯肼做显色剂替代安替比林的说明,39,反应方程式：,C,6,H,3,(NO,2,),2,NHNH,2,+CO(NH,2,),2,C,6,H,3,(NO,2,),2,NHN=C(NH,2,),2,+H,2,O,40,