免疫组化ABC法

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,免疫组化ABC法,1,组织抗原,第一抗体,第二抗体,HRP,生物素,亲和素,原理：,酶标记Biotin形成酶素化,Biotin,一,ABC,法,酶素化BiotinAvidin- ABC复合物,抗原-特异抗体- Biotin标记二抗- Avidin Biotin HRP,实验原理,2,步骤：,三步法,优点：,敏感性较高,特异性强,应用范围广,缺点：,某些脏器存在内源性生物素干扰,Avidin与糖基、纤维组织、核酸及细胞膜中 磷脂有非特异反应,3,实验步骤,一、切片和脱蜡,切5-10微米的薄片，贴于载玻片上，脱蜡后进行后续反应。步骤如下：,（1）二甲苯脱蜡,（2）梯度酒精水化（无水酒精、95%酒精、90%酒精、85%酒精、80%酒精）,二、微波修复抗原,免疫组化ABC法,4,实验步骤,三、ABC法,含1% Triton X-100和0.03 %H2O2的0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS, pH7.4)室温15min；,含3%牛血清白蛋白(BSA, Sigma)和1%正常羊血清(NGS, Vector)的0.01 mol/L PBS室温30min；,免疫组化ABC法,5,实验步骤,一抗室温孵育过夜。抗体用含3%牛血清白蛋白(BSA，Sigma)和1%NGS的0.01 mol/L PBS稀释(下同)；,0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次5min;,生物素化二抗室温孵育2h;,免疫组化ABC法,6,实验步骤,0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次5min;ABC(1:100, Vector) 室温2h;,0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次5min;含0.03%DAB和0.006% H2O2的Tris盐酸缓冲液(TB, pH7.6)室温1015 min。,免疫组化ABC法,7,实验步骤,（10）0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次5min;,（11）贴片，甘油封片,四、观察结果并分析,免疫组化ABC法,8,实验对照设置,免疫组化ABC法,对照染色的目的,-排除假阴性和假阳性。,9,