免疫学试验技术

,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,免疫学试验技术,概 论,免疫学技术 利用免疫学反应的特异性原理建立的各种检测与分析技术以及建立这些技术的各种制备方法。,包括 ：,免疫血清学技术 用于抗原或抗体检测的体外免疫反应技术；,细胞免疫技术 用于研究机体细胞免疫功能与状态的技术；,免疫制备技术 指制备与免疫检测有关制剂的各种技术。,一、细胞免疫,技术,淋巴细胞计数与分类,淋巴细胞功能测定,细胞因子测定,E玫瑰花环试验,T细胞亚群检测试验,淋巴细胞转化试验,细胞毒性T细胞试验,巨噬细胞移动抑制试验,白介素测定,干扰素测定,用 途,免疫机理 诊断 治疗 药物选择,类 型,+ + - +,+ - - +,+ + - +,+ + - +,+ + - +,+ - + +,+ - + +,体内细胞免疫试验,皮肤试验,+ + - +,试验名称,（一）淋巴细胞计数与分类,1.,淋巴细胞数量检测技术,1.1 T细胞E玫瑰花环试验 检测T细胞,T淋巴细胞表面CD2分子是绵羊红细胞（SRBC）受体，也称E受体，在一定条件下，SRBC环绕T细胞与之结合，形成花环状，称E花环（E-rosette），形成此种花环的细胞称E花环形成细胞。,1.2 EA玫瑰花环试验 检测B细胞,B淋巴细胞有表面Fc受体，以鸡红细胞作为指示细胞与相应的抗红细胞抗体形成EA，B淋巴细胞可以通过Fc受体与EA形成花环，以此计算B淋巴细胞的数目。,1.3 EAC玫瑰花环试验 检测B细胞,B淋巴细胞表面具有补体C3受体，红细胞可与相应的抗体结合形成抗原抗体复合物（EA），进而与补体结合( EAC)，然后与B淋巴细胞表面的补体C3受体结合而形成花环，以供计数B淋巴细胞。,1.4 酯酶染色法 ANAE,+,检测T细胞,T淋巴细胞的胞浆内存在着酸性a 醋酸萘酯酶(ANAE,+,)，在酸性条件下，能使底物醋酸萘酯水解产生a 萘酚， 而a 萘酚与六偶氮副品红作用形成不溶性的红色沉淀物而沉积在T淋巴细胞胞浆内酯酶所在的部位。,2.T细胞亚群检测技术,T细胞总数：CD,3,；T,H,:CD,4,；T,c,:CD,8,应用针对CD抗原的单抗来鉴别各T细胞亚群。,2.1 间接免疫荧光法,分离淋巴细胞 CD单抗 荧光二抗,镜检计数,2.2 流式细胞术,分离淋巴细胞 CD单抗 荧光二抗,FACS测试管 计数,（二）淋巴细胞功能测定,淋巴细胞转化试验 淋巴细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原（如PHA、ConA）或特异性抗原刺激后，可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、细胞体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞，此称为淋巴细胞转化现象。淋巴细胞转化率的高低，可以反映机体的细胞免疫水平，因此，可作为测定机体免疫功能的指标之一。,淋巴胞转化试验的方法有形态学方法、MTT法、3H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入法。,A、形态学方法,1、原理,淋巴细胞在体外培养过程中受有丝分裂原如植物血凝素（PHA）等刺激后，可转化为体积较大的母细胞，胞浆增多而深染，核增大并可见核仁部分细胞可出现有丝分裂，计数转化细胞的百分率可反映机体的细胞免疫功能。,2、方法,（1）取无菌肝素抗凝血0.1ml，加入1.8ml细胞培养液中，同时加入PHA（1000g/ml）0.1ml，对照管不加PHA，将细胞置37、5%CO2培养3天，每天摇动1次。,（2）培养结束时吸弃大部分上清液，加入4mlNH4Cl（8.5g/L）混匀，置37水浴10min。,（3）2500r/min离心10min后弃去上清液，沉淀加5ml固定液，室温作用10min。,（4）离心（2500r/min，10min）后弃上清液，留0.2ml沉淀细胞制片，迅速吹干。,（5）吉姆萨染色1020min，水洗，干燥。,（6）油镜计数200个淋巴细胞中转化的细胞数，计算转化率。,3、结果,（1）淋巴母细胞的形态学标准是细胞核的大小，核与胞浆的比例、胞浆染色性及核的构造与核仁的有无。,成熟的小淋巴细胞：与未经培养的小淋巴细胞一样为68m，核染色质致密，无核仁，核与胞浆比例大，胞浆染色为轻度嗜碱性。,过渡型淋巴细胞：比小淋巴细胞大，约1020m，核染色质致密，但出现核仁，此为与成熟小淋巴细胞鉴别要点。,淋巴母细胞：细胞体积增大，约2030m，形态不整齐，常有小突出，核变大，核染色质疏松，有核仁12个，胞浆变多，常出现胞浆空泡。,其它细胞：如中性粒细胞在培养72h后，绝大部分衰变或死亡呈碎片。,（2）淋巴细胞转化率的计算按上述分类检查推片头体尾三部分，计数200个淋巴细胞，算出百分率。,转化的淋巴细胞包括淋巴母细胞和过渡型淋巴细胞，未转化的淋巴细胞指的是成熟的小淋巴细胞。在正常情况下，PHA诱导的淋巴细胞转化率为60%-80%，如为50%-60%则偏低，50%以下则为降低。,图 淋巴细胞转化示意图,B、MTT法,1、原理,MTT法即四甲基偶氮唑盐微量反应比色法。MTT是一种噻唑盐，化学名3-（4，5二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯溴化四唑，水溶液为黄橙色。淋巴细胞受到ConA作用红发生增殖活化，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，MTT作为其底物参与反应，形成蓝色的甲臢颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经SDS/盐酸-异丙醇溶解为蓝色溶液，可用酶标测定仪测定细胞培养物的OD值，测定波长570nm。根据OD值的大小计算反应体系中细胞增殖程度。,2、方法,（1）淋巴细胞的分离与培养,常用来分离淋巴细胞的分层液（聚 蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(FH)分层液，比重是 1.0770.001 ）。,Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2gml时仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到淋巴细胞。,取抗凝血1ml，加入37预温的PH7.4 0.01M PBS溶液1ml，混匀后加在1ml淋巴细胞分离液上，2500rlmin离心10分钟，用毛细滴管尖伸入单核细胞层，经轻吸出全部细胞悬液。用37预温的PH7.4 0.01M PBS溶液洗2次，第一次2500r/min15分钟。第二次10分钟。弃上清，将沉积细胞用pH7.4含10%小牛血清的RPMI-1640营养液液配成1210,6,个/ml的单细胞悬液，100l/孔，接种于96孔平板，并加入适量的ConA液。置37、5% CO2 培养箱中培养48小时。,（2）加入5mg/ml的MTT溶液(10l/孔)，于振荡器上混匀后约1min，置37、5% CO2 培养箱中培养4-6小时。,（3）取出培养板，每孔加入10%SDS-0.01mol/LHCL100ul, 置37、5% CO2 培养箱中培养2小时后，取出，室温下将平板置于微孔板振荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。,（4）使用酶联检测仪检测波长570nm下的吸光度值。,【注意事项】,1.操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀，避免损伤细胞活性及细胞丢失。,2.细胞分层液在室温下应为(l.0770.001) g/L；应避光4 下保存，取出后逐渐升至室温后混匀，方可使用。使用中应避免细菌污染。,3.稀释血液可降低红细胞的凝集，提高淋巴细胞收获量，但如果要保留血浆成分作其他实验用时，则不能稀释血液，以免影响血浆成分。,C、3H-TdR掺入法：,正常情况下，细胞通常处于细胞周期的,G0,期，受特异性抗原或丝裂原激活后，从,G0,期进入,G1,期，并合成蛋白质、,RNA,和,DNA,前体物质等，为,DNA,复制准备物质基础，然后进入,S,期，细胞合成,DNA,量倍增，此时若在培养液中加,3H,标记的,DNA,前体（,3H-,胸腺嘧啶核苷，,3H-TdR,），后者即掺入新合成的,DNA,中，根据掺入的多少推测细胞增殖程度 。掺入同位素用液体闪烁测定仪测量，计算,cpm,(,每分钟脉冲数,),，用以下公式进行计算刺激指数：,（三）细胞毒性T细胞CTL)试验,将靶细胞（肿瘤细胞、病毒感染细胞)等，与致敏的淋巴细胞混合培养，然后检测靶细胞的死亡情况。,形态学检查法：根据体外贴壁生长的靶细胞被CTL杀伤后失去贴壁的能力，因此从贴壁细胞数目的减少情况即可判断CTL的功能。,51,Cr释放法两种方法：将,51,Cr标记的靶细胞与致敏淋巴细胞一同培养，靶细胞被CTL杀伤后，,51,Cr即释放到培养液中，用r-计数仪测定培养液中,51,Cr的脉冲数（cpm)即反应出CTL杀靶细胞的能力。,Thank You !,不尽之处，恳请指正！,