岛津LC-10AT型液相基础知识

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second Level,Third Level,Fourth Level,Fifth Level,*,*,第一节,岛津LC-10AT型HPLC操作规程,1,目的:,规范岛津LC-10AT型高效液相色谱仪的使用。,范围:,适用于岛津LC-10AT型高效液相色谱仪的使用。,职责:,质检员对本规程的实施负责。,2,一、,系统组成,本系统由2个LC-10ATvp溶剂输送泵（分主/A泵和副/B泵）、Rheodyne 7725i手动进样阀、SPD-10Avp紫外-可见检测器、N2000色谱数据工作站和电脑等组成，另外还包括打印机、不间断电源等辅助设备。,3,二、,准备,1,、,准备所需的流动相，用合适的0.45m滤膜过滤，超声脱气20min。,2,、,根据待检样品的需要更换合适的洗脱柱（注意方向）和定量环。,3,、,配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适的0.45m滤膜过滤。,（注意腐蚀性与有机系的的溶剂）,4,、,检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。,4,接通电源，依次开启不间断,电源,、,B泵,、,A 泵,、,检测器,，待泵和检测器自检结束后，打开打印机、电脑显示器、主机，最后打开色谱,工作站,。,三、,开机,5,四、,参数设定,1,、,波长设定：在检测器显示初始屏幕时，按func键，用数字键输入所需波长值，按Enter键确认。按CE键退出到初始屏幕。,2,、,流速设定：在A泵显示初始屏幕时，按func键，用数字键输入所需的流速（柱在线时流速一般不超过1ml/min），按Enter键确认。按CE键退出。,3,、,流动相比例设定：在A泵显示初始屏幕时，按conc键，用数字键输入流动相B的浓度百分数，按Enter键确认。按CE键退出。,6,四、,参数设定,4,、,梯度设定,：,4.1,：,在A泵显示初始屏幕时，按edit键，Enter键；4.2,：,用数字键输入时间，按Enter键，重复按func键选择所需功能（FLOW设定流速，BCNC设定流动相B的浓度），按Enter键，用数字键输入设定值，按Enter键；4.3,：,重复上一步设定其它时间步骤；4.4,：,用数字键输入停止时间，重复按func键直至屏幕显示STOP，按Enter键。按CE键退出。,7,五、,更换流动相并排气泡,1,：,将A/B管路的吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶中；,2,：,逆时针转动A/B泵的排液阀180，打开排液阀；,3,：,按A/B泵的purge键，pump指示灯亮，泵大约以9.9ml/min的流速冲洗，3min（可设定）后自动停止；,4,：,将排液阀顺时针旋转到底，关闭排液阀。,5,：,如管路中仍有气泡，则重复以上操作直至气泡排尽。,6,：,如按以上方法不能排尽气泡，从柱入口处拆下连接管，放入废液瓶中，设流速为5ml/min，按pump键，冲洗3min后再按pump键停泵，重新接上柱并将流速重设为规定值。,8,六、,平衡系统,1,、,查看基线,：,1.1,：,按N2000色谱数据工作站操作规程打开“在线色谱工作站”软件，,1.2,：,输入实验信息并设定各项方法参数后，,1.3,：,按下“数据收集”页的 按钮。,9,六、,平衡系统,2,、,等度洗脱方式,2.1,：,按A泵的pump键，A、B泵将同时启动，pump指示灯亮。用检验方法规定的流动相冲洗系统，一般最少需6倍柱体积的流动相。,2.2,：,检查各管路连接处是否漏液，如漏液应予以排除。,2.3,：,观察泵控制屏幕上的压力值，压力波动应不超过1MPa。如超过则可初步判断为柱前管路仍有气泡，按,检查管路后再,操作。,2.4,：,观察基线变化。如果冲洗至基线漂移0.01mV/min，噪声为25mmol/L,的缓冲液,4.,每天冲洗柱,5.,稳定进样条件,调节流动相,6.,采用保护柱,40,二、,保留时间缩短,1.,流速增加,2.,样品超载,3.,键合相流失,4.,流动相组成变化,5.,温度增加,1.,检查泵,重新设定流速,2.,降低样品量,3.,流动相,PH,值保持在,37.5,检查柱的方向,4.,防止流动相蒸发或沉淀,5.,柱恒温,41,三、,保留时间延长,1.,流速下降,2.,硅胶柱上活性点变化,3.,键合相流失,4.,流动相组成变化,5.,温度降低,1.,管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡,2.,用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱,3.,流动相,PH,值保持在,37.5,检查柱的方向,4.,防止流动相蒸发或沉淀,5.,柱恒温,42,四,、,出现肩峰或分叉,1.,样品体积过大,2.,样品溶剂过强,3.,柱塌陷或形成短路通道,4.,柱内烧结不锈钢失效,5.,进样器损坏,1.,用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的,15%,2.,采用较弱的样品溶剂,3.,更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件,4.,更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品,5.,更换进样器转子,43,五、,鬼峰,1.,进样阀残余峰,2.,样品中未知物,3.,柱未平衡,4.,三氟乙酸,(TFA),氧化,(,肽谱,),5.,水污染,(,反相,),1.,每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗,2.,处理样品,3.,重新平衡柱,用流动相作样品溶剂,(,尤其是离子对色谱,),4.,每天新配,用抗氧化剂,5.,通过变化平衡时间检查水质量，用,HPLC,级的水,44,六、 基线噪声,1.,气泡,(,尖锐峰,),2.,污染,(,随机噪声,),3.,检测器灯连续噪声,4.,电干扰,(,偶然噪声,),5.,检测器中有气泡,1.,流动相脱气,加柱后背压,2.,清洗柱,净化样品,用,HPLC,级试剂,3.,更换氘灯,4.,采用稳压电源,检查干扰的来源,(,如水浴等,),5.,流动相脱气,加柱后背压,45,七、,峰拖尾,1.,柱超载,2.,峰干扰,3.,硅羟基作用,4.,柱内烧结不锈钢失效,5.,柱塌陷或形成短路通道,6.,死体积或柱外体积过大,7.,柱效下降,1.,降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相,2.,清洁样品,调整流动相,3.,加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相,PH,值,钝化样品,4.,更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品,5.,更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件,6.,连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管,7.,用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱,46,八、,峰展宽,1.,进样体积过大,2.,在进样阀中造成峰扩展,3.,数据系统采样速率太慢,4.,检测器时间常数过大,1.,用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的,15%,2.,进样前后排出气泡以降低扩散,3.,设定速率应是每峰大于,10,点,4.,设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的,10%,47,八、,峰展宽,5.,流动相粘度过高,6.,检测池体积过大,7.,保留时间过长,8.,柱外体积过大,9.,样品过载,5.,增加柱温,采用低粘度流动相,6.,用小体积池,卸下热交换器,7.,等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱,8.,将连接管径和连接管长度降至最小,9.,进小浓度小体积样品,48,谢 谢！,49,