荧光定量PCR仪器简介-liuyi

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,荧光定量,PCR,仪器简介,湖南圣湘生物科技有限公司,刘昳,主要内容,荧光定量,PCR,仪的概述,PCR,仪的硬件介绍,各款,PCR,仪的介绍,荧光定量,PCR,仪的概述,94,57,72,水浴锅,PCR,荧光定量,PCR,金属浴锅,PCR,1,、,PCR,仪的发展历史,2,、荧光定量,PCR,仪的发展历史,Perkin-Elmer Cetus,仪器公司推出第一台热循环仪,ABI Prism 7700,第一个高通量的实时荧光,PCR,仪,Bio-Rad iCycler,2000,年后更多质优价廉的仪器进入市场，通量更高,1985.11,1996,年,1998,年,1999,年,2000,年,ABI,推出,7900HT,荧光定量,PCR,仪,Roche,推出第一台全自动荧光定量,PCR,仪,Lightcycler 1.0,3,、荧光定量,PCR,仪的组成,一台,PCR,仪主要由控温系统和光源系统两大组件构成。,所谓实时荧光定量,PCR,技术，是指在,PCR,反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个,PCR,进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,通过仪的热循环系统的升降温变化，使得核酸片段得以复制，仪器光学系统采集伴随核酸扩增产生的荧光信号，并对荧光信号进行分析转化、数学运算后，得到扩增曲线。,4,、荧光定量,PCR,仪的原理,Taqman,探针,4,、荧光定量,PCR,仪的原理,5,、荧光定量,PCR,仪的应用,基础科学研究,疾病检测与治疗检测、预后,优生优育及遗传筛查,基因表达分析,临床医学应用,肿瘤分型,/,耐药性评估,食品卫生检疫及安全评估,医院检验科、感染病科等,疾控中心,血站、血液中心,研究所等机构,食品监督管理局,海关进出口检疫,高端,市场份额被国外厂商所占领，尤其是在科研，,CDC,和血站等系统，国外厂商更是处于垄断地位，主要有,ABI,、,Roche,、,MJ,、,Bio-Rad,、,Stratagene,、,Corbott,、,Cepheid,等,国内企业多集中在中低端市场,，如,上海宏石、,西安天隆、达安基因、杭州博日等品牌。,高端市场,低端市场,5,、荧光定量,PCR,仪的市场情况,高通量,高速度,自动化,灵活化,4,3,2,1,8,大系列,互联网化,5,6,、荧光定量,PCR,仪的发展趋势,PCR,仪的硬件介绍,1,、硬件组成,光学系统：,激发光源和,检测系统；,热循环系统：,加热和制冷系统；,信号处理系统；,2,、激发光源比较,卤素灯,激光（氩离子）,LED(,发光二极管）,Xenon lamp,（氙灯）,优点,发射光谱宽（全光谱）且连续；,光源强，且激发光强度与大多数荧光的强度相似。,光源强度大，光透性好。,冷光源，无需预热，且使用寿命长；成本低，技术成熟。,利用氙气放电发光，光源强度大；发射光谱范围宽适合多种荧光染料的应用。,缺点,热光源，预热耗时，而且寿命短（约,2000h),。,发射光谱范围 窄；,成本高；,产热，耗电，寿命短。,亮度稍低，发射光谱范围窄且不连续；荧光素的选择有限，固定激发波长；和卤素灯相比光强弱。,成本比卤钨灯稍高；,发射光谱不宽（,430-630nm,）,应用仪器,ABI7000, 7300,7500; PE5700;,i-cycler,Mx3000p,ABI Prism 7900, 7700,Roche LC 1.5,2.0,ABI step one/plus,Bio-Rad MJ Opticon2,Da7600;Fluocycle; Slan8.0 ,Roche LC 480,Laser:,高强度,波长范围窄,Tungsten lamp:,中等光强,波长范围宽,Light emitting diode:,低的光强，波长范围窄,Halogen Lamp,2.,激发光源比较,激光的激发范围,(488-514nm),石英卤钨灯激发范围,(,350-750nm),2.,激发光源比较,光电倍增管,(PMT),电荷耦合装置（,CCD,）,光电二极管,(PDT),优点,信噪比高；,背景噪音信号低；,对较低的光信号敏感度高；,检测范围宽。,同时对正版进行拍照成像；,在同一循环中可对版面照多张照片。,成本很低；,设备体积小。,缺点,成本较高；,边缘效应；,灵敏度比,PMT,差。,信噪比低；,灵敏度不好。,应用仪器,Roche LC 1.5 and 2.0; Bio-Rad, MJ-opticon2;,Stratagene,系列；,Line-Gene FQD33A,，,slan8.0,ABI,系列；,Roche LC 480;,Bio-Rad, i-cycler,ABI,StepOne,and,StepOneplus,; Da7600;,Fluocycler,3,、检测装置比较,3,、检测装置灵敏度比较,光电二级管,室温,CCD,冷,CCD,PMT,(,光电倍增管,),Sensitivity,PMT,可以检测到很宽的波长范围，并对信号有放大作用,CCD,检测范围宽,易受背景信号噪音影响,整体检测时间较长,光电二极管可以检测到很宽的波长范围,检测灵敏度低,冷,CCD,装置与普通,CCD,相比：,冷,CCD,能降低图像噪音，提高图像质量和灵敏度。,3,、检测装置,PMT,和,CCD,检测原理比较：,hv,e,-,hv,光信号得以扩增.,获得更大的检测信号和更高的灵敏度,无边缘效应,光子释放出电子，使检测器留下一个带正电荷,正电荷记数作为检测信号,信号没有得以放大,有边缘效应,4,、加热系统：空气加热,速度快；管间温度均一性好；无需金属的精密加工；成本低；,对环境温度要求高：不能低于室温（,15 - 35,）,;,灵活性差：不能做温度梯度；,样本数量少（罗氏毛细管,32,个）。,金属热块的加热和降温分别通过电阻丝和半导体来控制。,特点：,温控范围大（,4 to 99,） ，均一性（,0.5,）；,灵活性好：可以做温度梯度；,样本数量多（,96,孔和,384,孔,),；,但其加热速度比空气加热稍慢。,4,、加热系统：半导体加热系统,风扇制冷,压缩机制冷,半导体制冷,优点,价格低,制冷快；,精确性好,控温性能强；,可低于室温；,体积小；可主动制冷。,缺点,精确度差；,不能主动制冷,体积大；,控温易过头（尤其在制冷时）；,破坏臭氧层；,技术要求高,风扇制冷 压缩机制冷 半导体制冷,5,、制冷系统,6,、荧光定量,PCR,仪的性能目标,通量大,通道多,灵敏度高,线性范围宽,反应体积大,运行速度快,各款,PCR,仪的介绍,PCR,仪的家族成员,进口,美国应用生物系统公司（,ABI,）,美国伯乐（,Bio-rad,）,瑞士罗氏（,Roche,）,美国安捷伦（,Agilent,）,德国凯杰（,Qiagen,）,德国艾本德（,Eppendorf,）,韩国柏业（,Bioneer,）,国产,杭州博日（,Bioer,）,上海宏石（,Slan,）,西安天隆（,Tianlong,）,上海枫岭（,Funglyn,）,厦门安普利（,Amplly,）,广州达安（,DA,）,上海科华（,Fluocycler,）,2007,年：,ABI Step one/Plus,2010,年：,ABI ViiA 7,ABI,仪器光学路径,Rox,：,(5-carboxy-x-rhodamine),5-,羧基,-X-,罗丹明,样本,1,样本,2,Rox,的功能：,1,）校正单次反应运行中由于泡沫或蒸发,/,冷凝而导致的信号改变；,2,）为故障分析提供一项强有力的诊断工具：每次循环采集参比染料信号，不受,PCR,反应影响；,3,）均一化校正由于移液误差或蒸发所导致的批内体积差异；,4,）均一化校正批间体积差异，提供更连续一致的批间重复,Ct,值。,ABI,仪器：校正染料,ROX,ABI,仪器：校正染料,ROX,的效果,7300,7500,7500fast,Step-one,Step-one plus,循环系统,Peltier,-based system,模块,96-well,96-well,96-well(fast),48-well,96-well,升降温速率,+/-1.1/s,+/-1.6/s,Fast-mode: +/-3.5/s,Fast-mode: +/-2.2/s,Fast-mode: +/-2.2/s,温度精确度,+/-0.25,+/-0.25,+/-0.5,+/-0.25,+/-0.25,光学系统,卤钨灯，单色激发，,4,色检测，,CCD,卤钨灯，,5,色激发，,5,色检测，,CCD,卤钨灯，,5,色激发，,5,色检测，,CCD,LED,灯，光电二极管，,4,色检测,蓝,LED,灯，光电二极管,4,色检测,运行时间,2h,2h,Fast-mode,：,30min,Fast-mode:,40min,Fast-mode:,40min,参比荧光,ROX or any calibrated dyes,样本容量,20-100ul (0.2ml),20-100ul (0.2ml),10-30ul (0.1ml),10-30ul (0.1ml,平盖，单管，,8,联）,10-30ul (0.1ml,平盖，单管，,8,联）,各款,ABI,主流荧光定量,PCR,的特点,罗氏定量,PCR,仪大家族,Light cycler 1.5,Light cycler 2.0,Light cycler 480,Light cycler nano,Light cycler 1536,罗氏,Cobas Ampliprep,空气后通过加热元件加热，热空气经过风扇的作用进入循环腔内；通过风扇的调节来保证空气循环和温度的均一性；加热时，风扇低速运转从而使得腔内的温度均匀；冷却时，风扇高速运转使加热枪和毛细管降温。,Roche LC1.5/2.0,荧光定量仪特点,Roche LC 1.5/LC2.0,性能参数,Roche LC 1.5,Roche LC 2.0,激发光源（通道）,LED(,单通道，,470nm10),LED(,单通道，,470nm10),检测元件（检测波长）,PMT(540,640,710),PMT(530,555,610,640,670,710nm20nm),室温要求,/,温度范围,15-35 /40 -98 ,样本容量,32,（,10-20ul,）,32 (20ul,，,100ul),检测通道模式,F1: SYBR Green I; F2,：,LC Red 640; F3: LC Red 705,Roche LC480,热循环系统组成和特点：,Thermal Block Cycler,包括了样本底座（,96,孔或,384,孔），,Peltier,元件，配合,Therma-BaseTM,热均衡器,，,银质散热块和电子元件,。,Block cycler cover (,热盖）,Multiwell plate loader, Multiwell plate detector, Multiwell plate bar-code scanner (,条形码扫描装置），,Block Cycler door with fans.,热盖,微孔板模块,Peltier,半导体加热单位,冷却装置,Therma-BaseTM,Roche LC 480,Roche LC 480,特有的温控元件,Therma-Base,Therma-Base,是一种热均衡器。,封闭的真空夹层，内壁为灯芯式结构，存贮工作液；,通过一系列的蒸发和凝结过程来调节控制温度,提升导热效率，提高孔间温度均一性,，孔间温度的精确度,0.1C,快速冷却和加热速度,H,eating: (4.8) C/s,Cooling: (2.5)C/s,整个板的精确,PCR,结果,96,孔模式, 1 hour,384,孔模式, 40 min,多孔板座,Peltier,元件,冷却装置：,银质散热鳍,Therma-Base,层,光源：,Xenon-lamp,Liquid light guide (,液芯光导向器,),Roche LC 480,光学系统组成及特点,激发和发射滤镜轮：,5,个激发波长和,6,个检测波长；半峰带分别为,25-40nm,和,20nm,；,氙灯：激发波长从,330nm,到,630nm,；需预热两分钟；平均寿命至少,500,个小时；易更换。,冷,CCD(1204x1344),温度被控制在,10,左右，降低了热噪作用。,Roche LC480,光学系统特点,光路特点：,如何解决边缘效应？,光源太近：,光强度够了，但边缘光信号根本无法收集；,光源太远：,整体光强度不够，且边缘信号弱。,Roche LC 480,独有的,compact instrument:,两个解决办法：,Field lens :,具有很好的光透性和光收集能力；使得激发和检测光的保持良好均一性；光线以近乎直角的角度经过热盖孔射到每个孔中；,2.,特殊的光路设计使样本与,CCD,达到最佳光程位置，光经过多次折射后到达检测系统。,孔间无阴影效应,很好地收集孔边缘光，不会造成边缘光的失真或变化,保证了整板的均一性和灵敏度,MyIQ,单色,PCR,Bio-rad IQ5,Bio-rad I Cycler,MJ Opticon2,Bio-rad CFX-96,伯乐定量,PCR,仪大家族,Bio-Rad Real Time PCR,仪性能特点,安捷伦定量,PCR,仪大家族,Strategene Mx3000P,Strategene Mx3005P,2001,年，,Strategene Mx3000P,2007,年，安捷伦收购,Strategene,。,Mx3000p,荧光定量,PCR,仪硬件,热盖,热循环系统,石英卤钨灯,发射光滤镜轮,激发光滤镜轮,光纤扫描,热循环系统特点：,半导体控温制冷（,Peltier,控温）,热盖加热,升降温速度,2.5,/s,温度均一性和准确性：,0.25,光学系统特点：,石英卤钨灯,激发端滤镜轮,发射端滤镜轮,PMT,检测器,同轴光纤,扫描式检测,96,孔板,1,使用,PMT,光电倍增管 （提高灵敏度且无边缘效应）, 2,光纤维扫描激发和检测, 3,光源：卤钨灯,扫描式检测模式：,恒定的强度，没有位置的相关性；,1.,所有,96,孔都用相同强度的光扫描，因此没有激发的差别,2.,所有,96,孔的发射光都经过相同的距离传输给,PMT,，因此没有检测距离的差别,避免了个样品间的光程差，无需内参校正。,整板读取,3.5,秒；,4,通道的扫描,16,秒；,5,通道的扫描要,20,秒,选择不同的染料后，分别扫描,滤镜轮转动,16 bit PMT,检测荧光,ROTOR Gene 3000,ROTOR Gene 6000,ROTOR Gene Q,凯杰定量,PCR,仪大家族,2008,年，,Qiagene,收购,Cobbert,。,LED,激发,PMT,检测,反应仓,-,空气流动使温度上升下降,主要特点：,空气加热，升温（,15,/s),和,降温,(,20 ,/s),速度快；,每通道独立,LED,灯光源，和滤光片，多达,6,个通道（,365-680nm,激发，,460-750nm,检测）；,PMT,检测，增益可调；,提供,Rotor0Disc,TM,OTV,进行光学温度校验；,36-well Rotor,72-well Rotor,0.2ml,普通,PCR,管，,0.1ml,四联管；,Rotor-Gene, Q,实时荧光定量,PCR,仪,-Qiagen,其他进口,PCR,仪,艾本德,Mastercycler,柏业,Exicycler TM96,LINE-GENEFQD-33A,LINE-GENEFQD-66A,LINE-GENEFQD-K,LINE-GENEFQD-96A,博日定量,PCR,仪大家族,博日,PCR,仪器加热模块,激发光,LED,Long life,maintenance-free,ultra-bright,荧光检测,PMT,Low Temperature Drift,ultra-sensitive,High-stable,博日,PCR,仪器光源系统,底部扫描方式，全板扫描时间少于,5,秒,博日,PCR,仪器荧光采集,SLAN-48,SLAN-96P,SLAN-96R,宏石定量,PCR,仪大家族,宏石,slan,荧光定量,PCR,仪,光源：,LED,灯,检测装置：,PMT(,光电倍增管）,温控系统：半导体加热,/,制冷,检测动力学范围：,10,0,-10,10,反应体积：,10ul-100ul,可选择的荧光染料：,FAM,SYBER;VIC,HEX,JOE,TET;ROX,TEXRAD,CY5,样本容量：,48,个（,20ul-100ul),SFDA, CETUVISO13485,认证（,2003,）,软件系统根据每管荧光值大小，自动选择增益值，无需手动设置；,检测灵敏度高，荧光背景值低，无需光学及背景校正。,Slan,的独特检测模式：,独立光纤传导扫描,侧面检测,提高了荧光采集效率，减小孔间荧光干扰,侧面检测，相对顶部透光，降低了对管盖透光性的要求,Genelight2400,Genelight9800,安普利定量,PCR,仪大家族,达安,DA7600,达安,PCR,仪,光源：,LED,灯,检测装置：,PMT(,光电倍增管）,温控系统：半导体加热,/,制冷,检测动力学范围：,10,0,-10,10,反应体积：,10ul-100ul,激发波长：,470nm,检测波长：,530nm,、,640nm,、,710nm,温度范围：,30-99,可选择的荧光染料：,FAM,SYBER; LC640 NHS ESTER;CY5.5,TYE705,样本容量：,48,个（,20ul-100ul),顶部激发，侧面检测模式：每一个孔都单独配置一个,LED,灯激发光源，,3,秒即可完成,48,组数据检测,优点,:,1.,顶部激发光,受光量充足,2.,侧面接收,接收光充足,3.,侧面接收,接收光装置简单,成本低,缺点,:,1.,接收光处易堵,模块需定期清洁,光电倍增管,滤光片,光纤束,数据处理系统,计算机,3,秒内完成,48,组数据的检测,DA7600,检测原理：独立,LED,灯激发，侧面检测,科华,PCR,仪,科华,fluocycler,TL 998A,TL 988,天隆定量,PCR,仪大家族,DA7600,博日,FQD-33A,上海枫岭,FTC3000,宏石,Slan8.0,科华,fluocycle,安普利,genelight,9800,西安天隆,TL988-II,激发光源（通道）,LED,（单通道,470nm,）,LED,（单通道）,卤钨灯（,400-750nm),LED,（三通道,470,530,585nm,）,LED,（单通道,470nm,）,固态激光（多通道）,LED(,二通道,470-505nm;525-545nm,）,检测元件,PDT,PMT,冷,CCD,PMT,PDT,PMT,PMT,热循环系统,半导体（,TE,）,半导体,（,TE,）,半导体,（,TE,）,半导体,（,TE,）,空气,电阻膜加热,/,压缩机制冷,半导体（,TE,）,支持模式,TaqMan,探针， 杂交探针，,SYBRGREEN I,， 分子信标，熔点曲线分析,检测波长,(nm),530,640,710,530,640,710,400-600,510,565,620,530,645,710,523-543nm;550-615nm,样品容量,480.2ml,320.2ml,96,64,320.2ml,480.2ml,3230ul,960.2ml,480.2ml,国产主流荧光定量,PCR,仪硬件技术参数,Thank You!,