质谱的原理和仪器构造

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,质谱,Mass Spectrometry,1,发展历史,上个世纪初英国学者,J.J.,汤姆森制成第一台质谱仪,第一台商品质谱仪,: 1942,年,早期应用：原子质量、同位素相对丰度以及研究电子碰撞过程等物理领域。,上个世纪,50,年代：高分辨率质谱仪出现，有机化合物结构分析；,上个世纪,60,年代末：色谱,-,质谱联用仪出现，有机混合物分离分析；促进天然有机化合物结构分析的发展；,计算机的应用又使质谱分析法发生了飞跃变化，使其技术更加成熟，使用更加方便。,2,1950,年至,1970,年：有机质谱迅速发展为测定有机化合物分子量和结构的强有力的工具。主要研究分子量小于,1000Da,的有机分子。,1981,年：出现了,快原子轰击质谱,，有机质谱开始分析研究极性大、热不稳定的多肽和小蛋白质等,1988,年：出现了,电喷雾电离质谱,、,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱,，,傅立叶变换质谱,法开创了有机质谱分析研究生物大分子的新领域。进入了生命科学的范畴。,近年来质谱与各种色谱的联用技术发展迅速。如,HPLC-ESI-MS,毛细管电泳,CE-ESI-MS,等，并发展了微量电喷雾电离接口技术。,3,质谱分类,4,目前质谱在药检领域的应用迅速增加，原因是许多保健品、中药制剂、食品等非法添加化学成分，需要做出鉴定，虽是中国国情使然，却也为仪器供应链创造了商机。,5,一、有机质谱的基本原理：,质谱仪原理的示意图：,进样系统,离子源,(,电离和加速，形成各种离子,),质量分析器,(,把不同质荷比的离子分开,),检测器,(,检测各种质荷比的离子,),数据处理系统。,6,主要过程：,在极高的真空度下,(10,-5,10,-8,Torr ),高能电子束,(10-70 eV),在离子源内激发样品的气态分子，离子源内分子由电子束作用失掉一个电子形成分子离子,M,+,。,由电子束获得的能量还能使分子离子进一步裂解，生成较小质量的,碎片离子,和一些,中性碎片,。,离开离子源的所有离子都被静电压,V,加速，然后进入与运动方向相垂直,强度为,H,的磁场。将离子按质荷比,(m/e),分开并按质荷比大小排列成谱图形式。,7,离子飞行方向依,m/e,的大小而偏转,(,曲率半径为,r),，其关系为：,质谱方程式,设计质谱仪器的主要依据,其中,k,是比例常数。也就是具有相同,m/e,的离子偏转程度相同。,8,二、质谱仪的具体组成,-,共六个单元,1.,进样系统,a.,探头,进样系统,一般最常用的探头有,电子轰击源,直接进样杆,快原子,轰击源直接进样杆等。,9,b.,储罐进样系统,包括储气室、加热器、真空连接系统及一个通过分子漏孔将样品导入离子源的接口。,气体和液体样品在不需要进一步分离时用此方式进样，储气罐可加热至,200,。此进样方式一般用于石油工业、环保等领域。,10,c.,注射泵进样系统,用于,ESI,(,电喷雾电离源,),和,APCI,(,大气压化学电离源）的直接进样。,d.,色谱进样系统,用于,GC-MS,HPLC-MS,CE-MS,11,2.,电离和加热室,(,离子源,),被分析物质在这里被电离，形成各种离子。不同性质的样品需用不同的电离方式。为使生成的离子到达质量分析器，在离子源的出口施加一个高电压即加速电压，对离子进行加速。不同的分析器有不同的加速电压。,离子源的种类很多，主要有电子轰击电离源（,EI,）,化学电离源（,CI,）,场致电离源（,FI,）,场解吸电离源（,FD,）,快原子轰击源（,FAB,）,激光解吸电离源（,LD,）,热喷雾电离源（,TS,）,电喷雾电离源（,ESI,）,大气压化学电离源（,APCI,）,基质辅助激光解析电离源（,MALDI,）等。,12,3.,质量分析器,功能：把不同质荷比的离子分开排列成谱，是质谱仪的核心。不同类型的质量分析器有不同的原理、特点、适用范围、功能。用于有机质谱仪的质量分析器有磁式双聚焦分析器，四极杆分析器，离子阱分析器，飞行时间分析器，回旋共振分析器等。,13,4.,检测器,检测各种质荷比的离子。检测器的种类有电子倍增器、光电倍增器、平板式微通道板检测器等。,现用得较多的是,光电倍增器,，永久性地密封于其自身的玻璃真空外壳中，这样可以保护光电倍增器在很宽的动态范围内，无论是检测正离子还是负离子，都能保持高灵敏度、恒定的增益和线性,并且使用寿命长达,10,年。,平板式微通道板检测器则用于飞行时间质谱仪,(,TOF,),。因为,TOF,作为质量分析器是脉冲式检测方式，离子按质量大小以不同的飞行时间依次到达检测器。这种平板式微通道板检测器具有极高的灵敏度。,14,5.,计算机、数据处理系统,在计算机未问世前，用反射式电流计，即被检测的每个,m/e,值的离子电流作用于电流计上，电流计的发射镜就把光束反射到光敏纸上，从而实行记录。,计算机系统的功能是对质谱仪进行控制，包括对质谱数据的采集、处理和打印。现有电子轰击源,(EI),的质谱仪的均有,NIST,标准谱库，谱库中有十几万张标准谱图及用于环保、农药、兴奋剂,代谢产物等专用谱库。可进行谱库检索。高分辨质谱仪其数据系统的软件则更丰富，还能给出分子离子和其他碎片离子的元素组成及理论计算值、偏差值,(,百万分之一,),饱和度等其他有关信息。,15,6.,真空系统,为了保证离子源中灯丝的正常工作，保证离子在离子源和分析器正常运行，消减不必要的离子碰撞，散射效应，复合反应和离子,-,分子反应，减小本底与记忆效应,质谱仪的离子源和分析器一般真空度都要求在,10,-5,-10,-8,Torr,才能工作。,真空系统由机械真空泵和扩散泵或涡轮分子泵组成。通常用机械泵预抽真空，然后用扩散泵或涡轮分子泵连续地抽气。,16,三、质谱仪的主要指标,三个主要指标,-,质量范围、分辨率、灵敏度,1,质量范围,(mass range),指质谱仪所检测离子的质荷比范围。对,单电荷离子,而言，就是指离子的质量范围。在检测多电荷时，所检测的离子根据其带多少个电荷而扩展其的质量范围。,17,2,分辨率,(resolution),分辨率,又称之为分辨本领。这是质谱仪的一个重要性能。一般规定：,当两个峰之间峰谷的高度超过两峰平均高度的,10%,时，则两峰没有被分开。,两峰部分重叠,18,磁式质谱仪的分辨率,R,的公式：,公式,1,M,：为可分辨的,两个峰的平均质量,M,：为质谱仪可分辨的,两个峰的质量差,。,由此可见,分辨率是质谱仪分开相邻两离子质量的能力,。,实际测量中将此公式写成：,R,10%,= ,公式,2,式中,a,为相邻两峰的中心距离；,b,为峰高,5%,处的峰宽；,对傅里叶变换质谱,FT-ICR,及飞行时间质谱仪,(TOF),而言，分辨率仍用公式,1,。,19,3,灵敏度,(senstivity),灵敏度是表示质谱仪出峰的强度与所用样品量之间的关系。是表示对所选定的样品在一定的分辨率情况下，产生一定信噪比的分子离子峰所需的样品量。,测定灵敏度的方法多种多样的，一般直接进样灵敏度的测定方法是：在固定分辨本领的情况下，直接进入微克量级的某种样品，看其,分子离子峰的强度与噪声的比值，就是信,/,噪比值，用,S/N,表示,。噪声指基线的强度。,20,4.,质量精度,利用质谱仪定性分析时，质量精度是一个很重要的性能指标。在,低分辨质谱仪,中，仪器的质量指示标尺精度,不应低于,0.4,质量数,。,高分辨率质谱仪,给出离子的精确质量，相对精度一般在,1-10ppm,。,21,四、质量分析器：,介绍五种不同的分析器,1,单聚焦,(single-focusing),和双聚焦,(double-focusing),质量分析器,单,聚焦质量分析器,-,使用,扇形磁场,。,双,聚焦质量分析器,-,使用,扇形磁场及扇形电场。,这二种质量分析器曾经是有机质谱的主体，现仍在继续发挥重要作用。,22,工作原理：在离子源中形成的各种,(,正,),离子都被加速电压加速，而获得动能：,公式,3,公式,3,中：,V -,加速电压；,v -,离子被加速后的速度；,ze -,离子所带电荷,(e,为电子所带的电荷量，,z,为正整数,),；,m -,离子质量。,23,被加速后的离子进入磁场，离子运动的方向和磁力线垂直。在磁场中，运动的离子如同电流，会与磁场产生相互作用力。离子受磁场的作用力作圆周运动。离子所受的磁场作用力提供离子作圆周运动的向心力。,公式,4,式中：,B,磁场强度,(,洛伦磁力,),r -,离子的运动轨道半径；,合并上述两式，消去,v,可得：,公式,5,24,这样,V,加速电压为定值，通过,B(,磁场强度,),的扫描，顺次记录下各质荷比离子的强度，从而得到所有,m/z,离子的质谱图。,不同质量的离子具有不同的轨道半径，质量越大，其轨道半径也越大。这意味着磁场有质量色散能力,可以单独用作质量分析器。,25,改变加速电,V(,对应离子动能的变化,),，离子的轨道半径也发生变化。当仪器将离子的运动轨道半径,r,固定后，公式,5,可改写为：,公式,6,式中，,k,为一常数。这表明，离子的质荷比,(m/z),与磁场强度的平方成正比，而与加速电压成反比。若将加速电压固定，扫描磁场则可测出样品分子生成的各种,m/z,值的离子。公式,6,还表明，增加磁场强度使仪器的质量范围增大；降低加速电压也能达到相同目的，但仪器灵敏度有所下降。,26,公式,3,所描述的是理想情况。事实上，离子在加速前，其动能并非绝对为零，而是在某一较小的动能值之内有一个分别。同一质量的离子，由于初始动能略有差别，加速后的速度也略有差别，因此它们经静磁场偏转后不能准确地聚焦于一点，也就是说,静磁场具有能量色散作用,。,因质量相同而动能略有差别的离子不能聚焦在一点，仪器的分辨率不是很高。,为提高仪器的分辨率，质量分析器除了采用一个扇形磁场外，还加上一个扇形电场，,静电分析器,(electrostatic analyser,ESR),又称静电场,，形成了双聚焦质量分析器。,27,静电场的作用,：,一束有一定能量分布的离子束，经静电场的偏转后，离子按能量的大小顺次排列。因此,静电场可看作是一个能量分析器,。,静电场有方向聚焦作用，也有能量色散作用,。加速后的离子在静电分析器中作圆周运动，所受的向心力由离子所受的电场力提供：,E,为静电分析器两极间的电位差,r,e,为离子在静电分析器中作圆周运动的半径。,28,如果设法使静磁场和静电场这二者的能量色散数值相等，方向相反，离子在通过扇形静电场和扇形磁场后，即达到,能量聚焦,。加上,方向聚焦,的作用，这就是,“,双聚焦,”,。,因此，扇形静电场加扇形磁场，达到了：,方向聚焦、能量聚焦、质量色散的目的,。将扇形磁场和静电场串联，并安排适当的离子光学参数，则在某点可达到方向和能量的双聚焦。离子在方向、能量都聚焦的情况下，质谱可达到高分辨。,29,按离子源、静电场分析器、磁分析器顺序排列为顺置型双聚焦质谱仪,还有,逆置型双聚焦质谱仪,，其,磁分析器位置在前，静电分析器位置在后,。这是最重要的质谱,/,质谱串联结构之一。,30,(,见图,3.,倒置型双聚焦质谱仪几何结构图,),。,在离子源与磁场之间的区域是第一无场区。磁场与电场之间为第二无场区，是最重要的无场区，可以设置各种碰撞室和电极，以观察离子的碎片反应。,31,2,四极质量分析器,(quadrupol mass analyzer),(quadrupole mass filter),四极质谱仪的质量分析器是由四根棒状电极组成，两对电极中间施加,交变射频场,，在一定射频电压与射频频率下，只允许一定质量的离子通过四极分析器而到达接收器。,32,图,4,四极质量分离器,33,当质荷比为,m/z,的离子沿,z,轴方向射入四极场时，其运动方程比较复杂，将其简化为：,+,（,a + 2qcos2,）,x = 0,马蒂厄微分方程,+,（,a + 2qcos2,）,y = 0,其中：,a = ,2,q = ,2, = t/2,34,方程的解非常复杂，所代表的物理意义可用,a,q,坐标的曲线可表示。,a,q,值在稳定区内的离子产生稳定振荡，顺利通过四极场到达检测器；,a,q,值在非稳定区的离子因产生不稳定振荡而被电极中和。操作仪器时，变化参数有,U,、,V,、,三个。一般固定,，,a/q=U/V,为常数对,V,进行扫描，可使一组不同质量的离子先后进入稳定区而被检测。,a/q,值越大,(,扫描成的斜率越大,),，在扫描线上稳定区的质量范围越窄，仪器的分辨率越高。,35,四极分析器的优点：,体积小、结构简单，价格便宜、维护方便，操作容易。,用电场无磁场，无磁滞现象，扫描快。,四极分析器缺点：,分辨率低；,对较高质量的离子有质量歧视效应。检测的质量一般在,1000,以内,36,3,离,子阱,(ion trap),质谱,离子阱技术是在上个世纪,50,年代提出的，但作为有机质谱质量分析器是在,80,年代中期以后。离子阱与四极质量分析器相似，有选择并储存离子的功能。样品的离子引入并储存在圆形电极和一组射频电极组成的离子盒中，改变射频逐个拉出所有的离子。离子阱质谱仪可作成,GC,和,LC,的检测器，并装配成体积小、价格低、高速扫描的新一代台式,GC/MS,、,LC/MS,仪,37,由三个特殊电极组成，两个端,盖电极,( end2cap ),和一个,环电极,( ring electrode),。,在,环形,电极上加,基础射频电压和直流电压,；在,端盖,电极上加,交流补充电压。,38,与四极杆分析器类似，离子在离子肼内的运动遵循,马蒂厄微分方程,，也有类似四极杆分析器的稳定图。由离子源产生的离子，通过脉冲离子门进入离子阱，通过调节射频电压和直流电压，离子可以稳定地存贮在离子阱中。阱中离子的数目可通过自动增益控制（,AGC,）技术进行有效控制。阱中离子数目太多，会引起空间电荷效应，导致电场的扭曲和整体性能的下降。离子阱中一般充入,1 mTorr,的氦气，它有两个作用，一是碰撞,“,冷却,”,降低初进入离子的动能，有效地捕获注入的离子；二是作为碰撞气体，从而产生多级,MS,。,特定,m,/,z,离子在阱内一定轨道上稳定旋转，改变端电极电压，不同,m/z,离子飞出阱到达检测器。,39,离子阱分析器的优点：,单一的离子阱可实现多极串联质谱,(MS),n,，是,“,时间上,”,的串联质谱，因此价格相比之下要比几个质量分析器串联而成的仪器要便宜很多。结构简单，价格低，性能价格比高。灵敏度高，比四极质量分析器高。,离子阱分析器的缺点：,是与标准图有一定差别，这是由于在离子阱中生成的离子有较长的停留时间，可能发生离子,分子反应，故有的离子阱采用外加离子源，这样使得离子阱在分析上得到更广泛的应用。,40,4,飞行时间质谱,飞行时间质谱仪的原理与仪器结构非常简单，核心部分是一个,离子漂流管,（,drift tube,）。把引入离子室的样品分子电离后，将离子加速并通过一个空管无场区，不同质量的离子具有不同的能量，通过无场区的飞行间长短不同，质荷比最小的离子具有最快的速度首先到达检测器，质荷比大的离子则较后到达检测器，可依次被收集检测出来。,41,在离子源中产生的离子经电压,V,加速后获得的速度为：,公式,8,式中，,ze,是离子的电荷，,m,是其质量。经过长度为,L,的漂移管到达检测器，离子飞行需要的时间,公式,9,从上述二公式看出，质量越大的离子飞行速度越小，到达检测器所需的时间也越长。两个质量分别为,m1,和,m2,的离子的飞行时间之差,公式,10,仪器的质量分辨率可近似地由时间表示，,公式,11,由此可见，,提高加速电压，使离子的飞行时间缩短，仪器分辨率就下降；而增加漂移管的长度，使离子的飞行时间增加，仪器分辨率就提高,。,42,飞行时间质量分析器突出的优点,:,一是不存在聚焦狭缝，因此灵敏度很高；二是扫描速度快，达,10000,张谱,/s,；三是测定的质量范围仅取决于飞行时间，可达到几十万质量数，为近年来生命科学中生化大分子的研究，提供了有效分析手段,但是，长时间以来一直存在分辨率低这一缺点，造成分辨率低的主要原因在于离子进入漂移管前的时间分散、空间分散和能量分散。这样，即使是质量相同的离子，由于产生时间的先后，产生空间的前后和初始动能的大小不同，达到检测器的时间就不相同，因而降低了分辨率。,43,二种技术解决办法,:(1),两极加速技术,(2),离子反射技术,44,5,傅里叶变换离子回旋共振质谱仪,(Fourier transfom ion cyclotron resonance mass spectrometer,FT-ICR),由于傅里叶技术的发展，新型的,ICR-FTMS,出现，与此同期发展的,FT-IR,和超导,FT-NMR,，开辟了现代有机结构傅里叶谱学分析的新时代。,ICR-FTMS,是一种具有超高分辨率和能测定大分子量的质谱仪器。,45,46,核心是带傅里叶变换程序,(FT,程序,),的计算机和捕获离子的分析室。傅里叶变换离子回旋共振,(FT-ICR),的分析室是一个置于均匀超导磁场中的立方空腔，离子的产生，分析和检测都在分析室进行。由电子束与样品碰撞产生的离子，在强磁场作用下被迫以很小的轨道半径运动，不产生可检出信号。如果在发射极上加一个快速扫频电压，若射频电压的频率正好与离子回旋的频率相同，满足共振条件时，离子吸收射频能量，轨道逐渐增大，产生可检出信号。这种信号是一种正弦波式的时间域信号，其频率与离子固有的回旋频率相同。振幅与离子数目成正比。实际测得的信号是在同一时间内所对应的正弦波信号的叠加，这种信号输入计算机进行快速傅里叶变换，便可检出各频率成分,利用频率和质量的已知关系可得到正常的质谱图。,=1.537x10,7,x zB/m,回旋频率（,）仅与磁场强度（,B,）和离子的质荷比（,m/z,）有关,47,傅里叶变换质谱计的优点：傅里叶变换质谱仪具有分辨率高,(,可达,100,万以上,),，灵敏度高,(,可达,pg,量级,),，扫描速度快和结构简单等特点。,1,分辨率极高，商品仪器的分辨率可达,1x10,6,。在一定频率范围内，只要有足够长的时间进行采集，即可获得高分辨的结果，不影响分辨率。,2,完成多级（时间上）串联质谱的操作。,48,五、电离源,介绍五种不同的电离方式,1.,电子轰击源,EI(electron impact ionization),是应用最为广泛的离子源，它主要用于挥发性样品的电离。,EI,电离是用具有一定能量的电子直接作用于样品分子，使其电离。,(,见图,10.,电子轰击源,EI,经过示意图,),。,49,EI,源中使用的灯丝是用钨或铼金属材料制成的。采用丝或带的形状，在高真空中被电流炽热，发射出电子。在电离盒与灯丝之间加以电压,(,正端在电离盒上,),，这个电压被称为电离电压。电子在电离电压的加速下经过入口狭缝进入电离区。样品汽化后在电离区与电子作用，一些分子获得足够能量后丢失一个电子形成正离子。在,EI,状态下，样品分子约有,1/1000,发生电离。,50,分子离子继续受到电子的轰击，使一些化学键断裂，或引起重排以瞬间速度裂解成多种碎片离子,(,正离子,),。,在电子轰击下，样品分子可能有四种不同途径形成离子：,1,样品分子被打掉一个电子形成,分子离子,。,2,分子离子进一步发生化学键断裂形成,碎片离子。,3,分子离子发生结构重排形成,重排离子,。,4,通过分子离子反应生成,加合离子,。,51,EI,源的特点：,电离效率高，能量分散小，这保证了质谱仪的高灵敏度和高分辨率。,EI,电离还有个特点是质谱图重现性好，并有较多的碎片离子信息，对推测未知物结构有帮助。,EI,标准谱库，大多数,EI,质谱图集或数据库收录在,70eV,下获得的质谱图。,缺点：,对不稳定化合物和不气化的化合物，经常得不到分子离子峰或得到丰度很低的分子离子峰。,52,2,化学电离,(chemical ionization, CI),有些化合物稳定性差，用,EI,方式不易得到分子离子,因而也就得不到分子量。为了得到分子量可以采用,CI,电离方式。,CI,和,EI,在结构上没有多大差别。或者说主体部件是共用的。其主要差别是,CI,源工作过程中要引进一种反应气体。此时样品分子与反应气分子相比是极少的，并在一定能量的电子的作用下，反应气分子被电离后因离子,-,分子反应产生一些活性反应离子，这些离子再与样品分子发生离子,-,分子反应，使样品分子实现电离。,53,CI,电离会产生多种准分子离子。,反应气有甲烷、氨、异丁烷等。,以甲烷气体为反应气产生下列反应,CH,4,+ e CH,4,+.,+ 2e,CH,4,+.,+ CH,4, CH,5,+,+ CH,3,.,CH,4,+., CH,3,+,+ H,.,CH,3,+,+ CH,4, C,2,H,5,+,+ H,2,优势反应离子,CH,3,+, C,2,H,5,+,这两个离子的共轭碱,CH,4, C,2,H,4,的低质子亲和力使其成为良好的质子供给体。,M + CH,5,+, MH,+,+CH,4,M + C,2,H,5,+, MH,+,+ C,2,H,4,由,CI,产生的准分子离子过剩的能量小，故,CI,属于软电离技术之一。准分子离子是偶电子离子，较,EI,产生的,M,+,(,奇电子离子,),稳定，因为,CI,没有奇电子离子的诸多碎裂反应，使得,CI,谱的准分子离子峰的强度高，便于识别。,54,3,快原子轰击,(fast atom bombardment, FAB),FAB,是上个世纪,80,年代初发展起来的一种软电离技术。属于二次离子质谱，以高能量的初级离子轰击，再对由此产生的二次离子进行质谱分析。,原子枪,样品,MH,+,Ar,0,/Cs,+,原子枪,样品,MH,+,Ar,0,/Cs,+,55,FAB,利用重的原子,Xe,或,Ar,，惰性气体的原子先被电离，后被电位加速，使其有较大的动能。在原子枪,(autom gun),内进行电荷交换反应；,Ar,+,(,高动能的,) + Ar(,热运动的,),Ar (,高动能的,) + Ar,+,(,热运动的,),低能量的离子被电场偏转引出，高动能的原子则对靶物进行轰击。把大量能量传递给样品分子，电离产生的二次离子被引入质量分析器中进行分析。,FAB,属于软电离，通常产生,M+H,+,和加合离子峰。,56,FAB,源适合分析,极性强、难气化、不稳定的化合物,。有时需加入一些金属离子，比如,NaCl,、,KCl,等，这样会出现加合离子峰，便于判别分子离子峰。,FAB,正逐渐被其它软电离技术所替代。因为,FAB,污染离子源，实验复杂。,57,4,基质辅助激光解析电离,(matrix-assister laser desorption-ionization,MALDI),MALDI,发展较晚，但在生物领域已发挥出它的重要作用。,58,MALDI,采用脉冲式的激光，在一个很微小的区域里，以极短的时间间隔,(,纳秒级,),，打在靶物上，避免样品加热分解。它的方法是将被测物,( mol/L,级的浓度,),的溶液和基质,(m mol/L,级的浓度,),溶液混合。蒸发溶剂，被测物质与基质成为晶体或半晶体。用一定波长的脉冲式激光进行照射。基质分子能有效地吸收激光的能量，使基质分子和样品投射到气相并得到电离。常用的基质有,2,，,5-,二羟基苯甲酸、芥子酸等。,MALDI,特点：,是碎片离子峰少，有分子离子、准分子离子及样品分子聚积的多电荷离子。适合分析蛋白、多肽、多聚糖等生物领域。,59,5.,大气压电离,(Atmospheric Pressure Ionisation, API),API,技术是当今质谱界最为活跃的领域，它的成功发展，扩展了质谱仪分析化合物的范围，特别是在生物化学、医学、药物代谢等领域获得日益广泛的应用。,API,包括了电喷雾电离,(Electrospray, ESI),和大气压化学电离,(Atmospheric Pressure Chemical Ionisation ,APCI),两种。它们的共同点是样品的离子化在处于大气压下的离子化室中完成，离子化效率高，大大增强了分析的灵敏度、稳定性，它们是目前最软的离子化技术。这二种方式都可以获得与分子离子有关的信息而得到化合物的分子量。,60,电喷雾电离源（,Electro spray ionization, ESI),的原理：,61,ESI,技术电离过程是,“,离子雾化,”,。样品溶液流出毛细管的瞬间，在加热温度，雾化气,(N2),和强电场,(3-5kv),的作用下。溶剂迅速雾化并产生高电荷液滴。随着溶剂分子的蒸发，带电液滴的半径逐渐缩小，液滴表面的电荷密度逐渐增大。当电荷之间的排斥力足以克服表面张力时，离子向表面移动并从表面蒸发，产生单电荷或多电荷离子。所带电荷的多少取决于所得的带正电荷或负电荷的离子中酸性或碱性基团的体积和数量。,62,通常小分子得到,M+H,+,、,M+Na,+,或,M-H,-,单电荷离子。而生物大分子则产生多种多电荷离子，在质谱图上得到多电荷离子的峰簇。因此质量范围只有几千质量数的质谱仪能够检测质量数几万甚至十几万的生物大分子如蛋白质、寡核苷酸等。,ESI,是最软的电离技术。适,合测定极不稳定的极性化合物、如多糖、蛋白等。,63,大气压化学电离,(atmospheric pressure chemical ionization,APCI,),的原理,64,溶液中的样品流出毛细管时被氮气流雾化，到加热管中被挥发，在加热管端进行电晕,(Corona),尖端放电，电极的高压使溶剂分子被电离，形成反应气等离子体。样品分子在穿过等离子体时通过质子转移被电离形成,M+H,+,或,M-H,-,离子，并进入质谱仪。,在,电晕放电电离,的设计中，取样微孔与电离反应区之间增加了层幕气流，避免微孔堵塞，又能使簇合离子解簇。,APCI,适合于弱极性小分子化合物。,65,六串联质谱,(tandem MS),为了得到更多的有关分子离子和碎片离子的结构信息，早期的质谱工作者把亚稳离子作为一种研究对象。所谓亚稳离子,(metastable ion),是指离子源出来的离子，由于自身不稳定，前进过程中发生了分解，丢掉一个中性碎片后生成的新离子，这个新的离子称为亚稳离子。研究亚稳离子对搞清离子的母子关系，对进一步研究结构十分有用。由于亚稳离子形成的几率小，亚稳峰太弱，检测不容易，而且仪器操作也困难，因此，后来发展成在磁场和电场间加碰撞活化室，人为地使离子碎裂，设法检测子离子，母离子，进而得到结构信息。这是早期的质谱,-,质谱串联方式。,66,随着仪器的发展，串联的方式越来越多。尤其是,20,世纪,80,年代以后出现了很多软电离技术，如,ESI,、,APCI,、,FAB,、,MALDI,等，基本上都只有准分子离子，没有结构信息，更需要串联质谱法得到结构信息。因此，近年来，串联质谱法发展十分迅速。,串联质谱可用,MS/MS,表示，随着串联级数的增强可表示为,MS,n,n,：表示为串联级数。,67,串联质谱技术的,优点,：,1.,选择性更高,2.,检测限更低,3.,谱图质量更好,4.,大大减少样品的提纯,5.,得到更多的结构信息,串联质谱技术的用途,1.,微量样品的检测,2.,脏样品的分析,3.,同分异构体的区分、化合物结构鉴定等等,68,串联质谱分类：,1,空间上的串联,：,两个以上的质量分析器联合使用，两个分析器间有一个碰撞活化室，目的是将前级质谱仪选定的离子打碎，由后一级质谱仪分析。这种串联质谱可以完成三种扫描方式,(1),子离子扫描,第一级质谱选择出的某质荷比的离子，通过碰撞室与惰性气体,(He,Ar,),等分子发生碰撞诱导断裂，生成若干产物离子，再第二个质量分析器测定，得到产物离子的质谱图。,(2),母离子扫描,即由第一个质量分析器在一个选择的质量范围内扫描，按离子质荷比的顺序，依次在碰撞室中进行,CID(,源内碰撞诱导分解,),。第二个质量分析器设置为通过某一个质荷比的离子。通过初始离子扫描，可以知道某一个选定质荷比的离子是由哪些母离子产生的。,69,(3),中性碎片丢失的扫描,即在两个质量分析器之间的碰撞室进行,CID(,源内碰撞诱导分解,),。两个质量分析器一起扫描，保持某一质荷比的差值，第二个质量分析器让第一个质量分析器选出的某一质荷比的离子通过。这样，就可以检测出若干成对的离子，它们有共同的中性碎片的丢失。,70,下面介绍三种串联方式：,1).QQQ,串联即采用三个四极质量分析器而以中间一个作为碰撞室，故表示为,QQQ,或,QqQ,(,其中,q,表示作为碰撞室,),。这种串联方式用得较多。可完成上述的,(1),、,(2),、,(3),三种操作模式的扫描，而且四级串联质谱完成这三种扫描方式特别简单。,2),混合式,(hybrid),串联质谱,用扇形电场质量分析器,(E),、扇形磁场质量分析器,(B),和其它质量分析器，如用四级质量分析器,(Q),混合使用。在每一个分析器后面都有检测器。在每二个质量分析器之间都有碰撞室。可进行多极产物离子的扫描，并可进行高、低能量的,CID,，从而获得较全面的离子碎裂的信息。,71,3),采用飞行时间质谱计作为第二个质量分析器,由于,TOF,能同时检测所有质荷比的离子，因而灵敏度高，适合用作第二级质量分析器。,72,2,第二类：时间上的串联质谱,前面已介绍过的离子阱和,FT-ICR,就是属于这种串联。因为质量分析器就只有一个，并可以达到多极,(MS,n,),。,离子阱：选择适当的,U,、,V,值，可选出某一个质荷比的离子储存在离子阱中，进行,MS,n,的测定。,FT-ICR/MS,与离子阱时间上的串联质谱相似，选择某离子后，采用两次扫频激发分别逐出质荷比大的和质荷比低的所有离子。并用选定质荷比离子的回旋频率激发此种离子。对子离子激发、检测，得子离子,(,产物离子,),的质谱。,时间上的串联质谱只能完成子离子扫描，不能进行母离子扫描和中性丢失扫描。,73,七色谱,-,质谱联用,74,GC/MS-,气相色谱,/,质谱联用,利用气相色谱毛细管柱对混合物样品进行分离，然后用质谱对气相中的离子进行分析。,GC-MS,主要由三部分组成：,色谱部分、质谱部分和数据处理系统。,Sample,Sample,5890,1.0,DEG/MIN,HEWLETT,PACKARD,HEWLETT,PACKARD,5972A,Mass,Selective,Detector,D,C,B,A,A,B,C,D,Gas Chromatograph (GC),Mass Spectrometer,Separation,Identification,B,A,C,D,A,D,B,C,MS,75,色谱部分和一般的色谱仪基本相同。由于色谱是在常压下操作，质谱是在真空下操作。采用大抽速的真空泵将二者直接相接。混合物经过毛细管分离后，在到达质谱前载气被抽走，样品分子到达离子源被电离。,GC-MS,的质谱仪部分可以是磁式质谱仪、四极质谱仪，也可以是飞行时间质谱仪和离子阱。离子源一般用,EI,方式较多。,GC/MS,适合于分析能气化并且不分解的物质。,76,2,LC/MS-,液相色谱,/,质谱联用,LC-MS,联用仪主要由高效液相色谱，接口装置（同时也是电离源），质谱仪组成。高效液相色谱与一般的液相色谱相同，其作用是将混合物样品分离后进入质谱仪。,LC/MS,用高效液相色谱和质谱联用的大大扩展了质谱仪的应用范围。,其接口技术比起,GC/MS,的连接要困难的多，其接口要完成,(1),将溶剂及样品气化；,(2),去除大量溶剂分子,(3),对样品分子的电离。,(4),能进行,CID,。,前面介绍过的,ESI,和,APCI,电离是近些年才被发展和广泛应用的,LC/MS,接口技术。各制造厂商有各自的接口，有,Z,字型的、有斜喷的、还有垂直可调的类型较多。,77,LC/MS,分析条件选择,:,1.,电离源选择：,ESI,和,APCI,在实际应用中表现出它们各自的优势和弱点。,ESI,适合于中等极性到强极性的化合物分子。,APCI,不适合多电荷的大分子分析，它的优势在于非极性或中等极性的小分子的分析。,2.,选择适当的流动相,:,这对仪器灵敏度影响较大。另外不挥发的缓冲液,(,含磷、氯等,),不能使用。,流动相的含水比例不宜过高，否则降低离子化效率。,3.,正负离子模式选择,正离子模式适合于碱性样品。负离子模式适合于酸性样品,。有些酸碱性并不明确的化合物，可优先选用,APCI,进行测定。,78,作为,LC-MS,联用仪的质量分析器种类很多，最常用的是四极杆分析器（简写为,Q,），其次是离子阱分析器（,Trap,）和飞行时间分析器（,TOF,）。因为,LC-MS,主要提供分子量信息，为了增加结构信息，,LC-MS,大多采用具有串联质谱功能的质量分析器,串联方式很多，如,Q-Q-Q,，,Q-TOF,等,79,