普通光学显微镜的使用及微生物的简单染色

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验五、普通光学显微镜的使用及微生物的简单染色,实验目的,；,实验材料,；,显微镜的构造,；,油镜的原理,；,实验任务,；,6.,实验步骤,；,7.,实验报告,；,8.,下次实验,。,1,内容提要：,实验1、观察制备好的装片 ；,实验2、每个同学自己动手单染三张片子进行观察,；,2,一、实验目的：,1.学习普通光学显微镜的构造和功能；2.学习并掌握油镜的原理和使用方法；3.学习微生物的简单染色，观察细菌的 形态。,返回,3,二、实验材料：,显微镜 载玻片 香柏油 擦镜纸,双层瓶 染色剂 滴管 菌液,返回,4,三、显微镜的构造：,1、机械系统,（,P15,图1）：,A）,单筒显微镜：,5,B）,双筒显微镜,6,C),倒置显微镜,7,显微镜的发展历史,（补充内容）,：,= =,R.,虎克在17世纪中期 19世纪中期的显微镜,20世纪初期,制做的复式显微镜,的显微镜,8,续上：,带自动照相机 装有场发射枪的 超高压透射,的光学显微镜,扫描电子显微镜,电子显微镜,= =,9,2、光学系统,（,P15,图1）,在光学系统中 ，物镜的性能最为关键，分为低、高、油镜头。油镜的放大倍数最大，在使用时比较特殊，需要在载玻片与镜头之间加滴镜油香柏油。,返回,10,四、油镜的原理：,放大倍数可100倍之大，焦距很短，光强度最大。,油=1.52（香柏油）,介质折射率 水=1.33,空气=1,玻璃=1.55,香柏油对光的折射率与玻璃相似，光线直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不但增加了照明度，而且使油镜的数值孔径增加，用,NA,表示，一般在1.21.4。低高倍镜头等干镜,NA,都低于1.0。若以可见光的平均波长为0.55,m,来计算，数值孔径通常在0.65的高倍镜只能分辨出距离不小于0.4,m,的物体而油镜的分辨率却可达到0.2,m,左右。可见显微镜的放大效能是由数值孔径决定的。,11,什么是数值孔径？,从物理学角度来看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制。,可表示为：,分辨率（,最大可分辨距离,）=,/2,NA,=,光波波长 ，,NA=,数值孔径值,（可见光波0.4 0.7,m）,NA=n*Sin,a,1.光线投射到物镜上的最大角度的数值孔径值 一半正弦；,2.乘上玻片与物镜间介质折射率积。,n,介质折射率，,a,最大折射角的半数,光线投射到物镜的角度愈大，分辨效能就愈大。物镜的分辨孔径愈大，光波波长愈短，明显的增强分辨率如油镜。,返回,12,五、实验任务：,1、观察制备好的装片；,2、每个同学自己动手单染,三张片子,进行观察。其中老师检查一片。,返回,13,六、试验步骤,1、涂片,左手持菌液试管,右手持接种环在火焰中灼烧,冷却后从试管中取菌液一滴,在洁净载玻片上做一涂膜;,从固体斜面或平板上取菌时,用无菌接种环取少量菌体,涂抹均匀于预先滴有的一滴自来水地玻片上;,14,2、干燥,在空气中自然干燥或在火焰快速通过干燥(与热固定同步进行).,3、热固定,用镊子夹住涂片一端,在火焰上连续通过几次;以载玻片在手背上试感觉不烫为宜.,15,4、染色,在固定的标本上加美兰（结晶紫）染液1-2滴,染色1,min,轻轻滴加水洗; 吸干, 加半滴水, 盖上盖玻片, 滴上半滴镜油油镜检。(到此实际上即为细菌普通染色),媒染：,揭去盖玻片,吸干水, 滴加1-2滴革氏碘液媒染1,min,轻轻水洗,吸干。,16,5、洗脱,滴加95%乙醇溶液(或30%丙酮乙醇脱色),轻轻摇动玻片至液滴无色,不要过分脱色(约30秒),立即轻轻滴加水洗;吸干。,6、复染,滴加蕃红染液复染3,min,轻轻滴加水洗;,吸干载玻片背面及标本周围水渍,滴上半滴水，盖上盖玻片,油镜镜检。,返回,17,七、实验报告要求：,1、根据观察的球，杆菌的观察实况画示意图，各一图。,2、用油镜观察时，为什么要求载玻片上加香柏油？,3、思考题(,4),影响显微镜分辨率的因素有哪些？,每个同学将自己制片的观察结果，报告老师，经检查合格登记，在课堂记录册上。,返回,18,八、下次实验：,微生物的革兰氏染色,请大家做好预习。,返回,19,