临床常见微生物标本采集法及影响临床微生物检验的因素

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,临床常见微生物标本采集法及影响临床微生物检验的因素,临床医生要求微生物室应做到,：,菌种鉴定准确,药敏试验准确,回报结果快速及时,做好咨询与解释工作,2,螺旋体,衣原体,支原体,病 毒,真菌,细菌,病原体,常见病原体种类,3,流 程,微生物学检查,个体治疗,感染性标本,诊断及鉴别诊断,感染性疾病,4,在细菌检验中，许多因素可以影响检测结果的准确性，我们在工作时应当加以注意，主要包括以下几个方面：,标本的采集与运送,细菌的鉴定及药敏试验,结果的审核与报告,5,标本的采集与运送对于检验结果的重要性,正确的采集与运送标本是保证检验结果准确的最基本条件，如果得不到一份合格的标本，鉴定及药敏结果再准确，结果也是不可信的。而从目前状况看，采集一份合格的标本，不是一件容易的事情，微生物检验标本的正确采集、运送及处理，与细菌的培养、鉴定结果有十分密切的关系，医生、护士、检验人员均应重视微生物标本的正确采集的有关问题,并有责任向患者及家属进行正确采集标本的宣传和指导.,6,典型案例,我们在临床检验工作当中遇到过这样的事情，脑积水患儿准备进行手术，术前三次脑脊液培养均分离出表皮葡萄球菌，脑脊液常规检查正常，污染菌？病原菌？临床请求会诊。,7,标本采集运送中的影响因素,抗微生物药物对标本的影响,抗菌药物抑制细菌生长，影响检出率，应当在应用抗微生物药物之前采集标本，或者停药35天采集标本，或在血浆药物浓度最低时采集标本。,8,标本留取是否正确,无菌部位的标本采集是要严格消毒，无菌操作，避免污染。如：血液、无菌体液。主要注意两个方面，一是穿刺部位的消毒，二是在将标本注入容器时的无菌操作。,9,如： 肺感染 痰,泌尿系感染尿,脓肿脓汁,颅内感染脑脊液,发热血、骨髓、尿等,根据可疑感染的部,采集相应的标本,10,临床实验室细菌分类,需氧、微需氧或兼性厌氧菌,非苛养菌：包括肠杆菌科细菌、假单胞类非发酵菌、不动杆菌、葡萄球菌属、肠球菌属、链球菌属（不含肺炎链球菌）,苛养菌：嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌,厌氧菌,11,标本采集和运送,标本采集的时间、部位、种类和数量,注明相关信息,（,由各种病原体所致感染性疾病的病程来决定）,12,微生物标本采集、运送、验收和处理注意事项,1、,标本采集,（1）申请单必须标记清楚姓名、性别、年龄、病原号、,标本来源（具体写明）,、,检查项目（目的要明确）,等，以便试验室能够合理选择培养环境和培养基。,（2）,尽量在抗生素应用前采集标本、以提高阳性检出率和避免漏检。,（3）标本采集应严格执行无菌操作。,（4）采集标本的容器必须经灭菌处理，不可用消毒剂。,13,2、,标本运送,（1）标本采集后应尽快运送到细菌室。,（2）标本采集后在,室温下超过2小时,未送到细菌室的，可视为不合格标本。,3、标本验收,（1）实验室只接受和处理合格标本。,（2）实验室对不合格标本退回必须说明原因、并及时与临床联系。,14,注意事项,（1）微生物检验样本必须要求采集转运，否则将影响检查结果，并给评价其意义带来麻烦甚至误导。,（2）微生物样本极易被污染，污染的样本杂菌大量繁殖抑制病原菌生长，条件致病菌也是致病菌，如污染条件致病菌将误导临床，造成对患者的损害以及经济和时间的浪费。,（3）某些标本离体极易死亡，应在床边采取和接种或立即保温送至实验室检验。室温放置或延迟送检，可使检出的阳性率降低；不能使用冷藏的样本检验。,（4）厌氧菌样本采取必须隔绝空气，混入空气的样本影响检验结果，不能使用。,15,血液标本,正常人血液是无菌的，血液标本病原学检查有助于菌血症、败血症的诊断和疑由菌血症所致其他症状，如皮疹、肝脾肿大、关节疼痛、昏迷休克等的鉴别诊断。并通过药敏试验为临床治疗提供合理的抗生素选择,。,16,采集时间,发热初期,寒战期,抗生素应用之前,下次用药之前,17,临床常见的采血指徵,发热（,38,C,）或低温（,36,C,）,寒战,白细胞增多（计数大于,10,，,000,10,9,/L,，特别有,“,核左移,”,未成熟的或杆状核的白细胞）,粒细胞减少（成熟的多核白细胞,1000,10,9,/L,）,血小板减少,皮肤粘膜出血,昏迷 ，休克,多器官衰竭,CRP,升高,采血,指徵,18,采集方法,2.采样量：,不少于培养基的1/10。,成人采血510ml,骨髓1-2ml,儿童采血15ml,3,.培养要求：除有明确的感染,特征，应同时送需氧、厌氧培养。,1,.采血部位：,肘静脉：无菌采集，1-3次,其他部位：亚急性心内膜炎等病,人，从肘动脉或股动脉等多次采,血,19,标本采集后立即送检, 不宜存放于冰箱,。,标本运送,20,采集数量对结果的影响因素,血培养的数量,研究表明，当每套血培养采血20ml时,一套检出率：65%,二套检出率：80%,三套检出率：96%,目前的指南推荐采集23套血培养,一套血培养瓶（Blood Culture Set）：血培养瓶接种的是同一来源的标本（同一穿刺）,Principle and Procedure for Blood Culture ， CLSI， M47-P, 2006,21,How many blood culture sets should be drawn?,需要抽取多少份血培养样本？,抽取2-3份血培养样本可使败血症病原菌检出率达到 99%,败血症患者在初期千万不要（NEVER draw only 1 blood）仅抽取一瓶血培养,注意：“份”是指单独的静脉穿刺的数量。,22,怀疑急性原发性菌血症,真菌菌血症,脑膜炎 2或3份血培养,骨髓炎,关节炎,肺炎,采血份数,徐英春，倪语星等。血培养操作规范，上海科学技术出版社，2002,1-31,23,血培养份数和时间,不明病源的发热，如：,隐性脓肿 采集2或3份,伤寒热,波浪热,估计体温升高之前,（下午）,再采2份以上,24h至36h后,徐英春，倪语星等。血培养操作规范，上海科学技术出版社，2002,1-31,24,血培养份数和时间,1h,2h内,采集3份,24h后阴性,再采3份以上,前2周,用抗生素,第1天,第2天,第3天,2份,2份,2份,急性心内膜炎,徐英春，倪语星等。血培养操作规范，上海科学技术出版社，2002,1-31,或可疑亚急性心内膜炎患者,每间隔一个小时采集一份,共采集3份标本.,25,送检目的：,有助于泌尿系感染的诊断和鉴别诊断,尿液标本,26,采集时间,细菌培养在未使用抗生素前取晨尿，结核,分枝杆菌检查应停用抗结核药物12天后,留24h尿送检.,27,因尿道口寄居有正常菌群,故采集标本应避免杂菌污,染。晨起第一次中段尿，保证尿液在膀胱内停留时,间4小时以上，留尿前 清洗外阴，排尿过程不要中,断，避免污染。培养后有四种以上细菌生长，考虑,污染，防止在尿袋中直接采集尿液标本。,尿液标本要定量报告,将尿液标本接种于增菌液中或离心后取沉渣进行培养都是错误的,。,采集办法,28,尿液标本的采集方法有:,2.导尿法、,3.肾盂尿采集法、,4.膀胱穿刺尿采集法、,29,中段尿采集法最常用的方法，女性患者用肥皂水冲洗外阴及尿道口; 男性患者用肥皂水冲洗尿道口，排出前段尿，再收集中段尿 35ml于无菌容器内送检,。,中段尿采集法,30,使用导尿管导尿是一种较好的无菌采集法,可,以防止杂菌染,。,导尿法,31,用导尿管采集肾盂尿,用于确定菌尿是否来自,肾脏。首先充分冲洗膀胱,以最后一次冲洗尿,作对照,然后用导尿管插入输尿管,分别标记左,右侧,收集三次尿;如果输尿管菌数比对照管菌,数多或第三次尿中菌数比第一次多,该菌尿可,能来自肾脏。反之，则可能来自膀胱。,肾盂尿采集法,返,32,将病人耻骨上皮肤经碘酒消毒后，以无菌空,针作膀胱穿刺。主要用于尿液厌氧菌的培,养，也可用于采集中段尿困难者或培养结果,与患者病情有矛盾时,。,膀胱穿刺尿采集法,33,用一洁净容器，留取24h尿液，取其,沉淀部份盛于清洁瓶内送检。主要,用于结核分枝杆菌的检查,。,24h留尿法,34,尿菌落计数低于标准时应考虑,如果尿培养菌落数较少 除考虑污染因素外，,还可能有以下原因：,用抗生素治疗,尿液稀释,尿频，在膀胱贮存时间短，菌落数少,尿道口消毒液混入标本中,35,标本采集后立即送检(1h内), 不能立即运送者应存放在4冰箱内保存。,标本运送,36,粪便标本,送检目的：粪便标本病原学检查有助于对一,些肠道感染性疾病进行病原学诊断和鉴别诊,断；为临床治疗提供合理的抗生素选择；及,对肠道菌群进行监测，预防菌群失调,。,37,总体原则：应在腹泻急性期(3天内)及用,药前采样。,1、腹泻患者于急性期，尽量在用药前采,集粪便。,2、伤寒患者于发病2周后采集粪便。,3、怀疑霍乱时立即采集粪便送检。,采集时间,38,1.自然排便采集法：,自然排便后，固体粪便挑取脓血、粘液部份23；液体粪便取絮状物23ml，盛于无菌容器内送检。,2.直肠拭子法：,对不易获取粪便者，将无菌棉签用甘油盐水湿润后，插入肛门内45cm(幼儿23cm)处，轻轻旋转，擦取直肠表面粘液后取出,插入无菌试管或保存液中送检,。,采集方法,39,标本采集后应立即送检(1小时以内), 不能立即,送检时应放入pH7.0的磷酸盐甘油中保存。,标本运送,40,呼吸道标本,上呼吸道标本：咽拭子、鼻拭子,下呼吸道标本：痰,41,上呼吸道标本：,最好在清晨，用清水漱口，由检查者将舌,向外拉，使悬雍垂向外牵引，用无菌棉拭,子在扁桃体区域、咽后壁及口腔溃疡处局,部反复涂抹采样，然后放入无菌试管内立,即送检,。,采集办法,42,下呼吸道标本：,要求采集肺深部的痰液, 避免采到唾液，常见方法：,自然咳痰法：最好采集晨痰, 在取标本之前, 用清水反复漱口几次，再从气管深部咳出第一口痰，盛入无菌容器中立即送检。,气管镜采集法：在病灶附近用导管或用支气管刷直接取得标本。,小儿采集法：用弯压舌板向后压舌，用无菌棉拭深入咽部，小儿经压舌刺激咳嗽时，可喷出肺部和气管分泌物，粘在棉拭上，将棉拭放入无菌管中立即送检。,气管穿刺法：通过气管穿刺取得痰液，主要用于厌氧菌培养。,43,通常以自然咳痰法采集标本最常见。应嘱咐患者晨起漱口，咳深部痰，告知唾液的培养结果对临床无指导意义，以便引起患者对留取标本的重视。检验痰液标本是否合格应进行涂片。,涂片合格后的痰标本建议使用盐水稀释方法接种于,相应培养基上,44,痰涂片显微镜检查判别标准,分类,细胞数/低倍视野,标本判别,白细胞,鳞状上皮细胞,A, 25,10,合格，用于细菌培养,B,25,1025,尚合格，可用于细菌培养,C,10, 25,不合格，建议重送标本,45,标本采集后应立即送检, 以防某些细菌在外环,境中死亡。作结核分枝杆菌或真菌培养的痰,液如不能及时送检，应置于4冰箱保存。,标本运输,46,分级,划线区菌落数目,1区,2区,3区,少见（1+）,10,少量（2+）,10,5,中量（3+）,10,5,5,多量（4+）,10,5,5,痰标本在平板上的菌落量化指标,注：1+ 多为污染，2+ 污染可能，3+ 感染可能，4+多为感染病原菌,47,一般应在用药之前或停止用药12天后采集标本。,1、脑脊液标本,（1）采集时间：怀疑脑膜炎时应立即采集脑脊液，最好是在应用抗生素之前采集脑脊液。,（2）采集方法:无菌腰穿采集,脑脊液1-3ML注入血培养瓶中,。,2、穿刺液标本,（1）穿刺液标本包括胸腹水、关节液等。,（2）无菌操作穿刺抽取标本1ML立即送检。,3、胃液及胆汁：抽取5ML左右后置于无菌管中立即送检。,4、深部脓液：用无菌注射器抽取后立即送检。,脑脊液与其他无菌体液标本,48,采集方法,1.脑脊液标本：无菌操作腰椎穿刺，抽取脑脊液23ml于无菌试管中送检。其它无菌体液标本以无菌操作抽取标本送检。,2.其他无菌性体液：无菌操作（浆膜腔穿刺液）大量留取,49,脑脊液标本采集后应立即保温送检或床旁接,种, 不宜置于冰箱保存。 胸水、腹水等无菌体,液标本采集后立即送检或置于冰箱4保存,。,脑脊液不能存放于标本,其他标本可放于冰箱保存,立即送检,标本运输,50,眼、耳部标本,无菌采集,拭子采样,局部麻醉后取角膜刮屑,立即送检,51,一般应在用药之前或停止用药710天采集标本,。,泌尿生殖道标本,52,男性尿道拭子,女性宫口取材,按摩前列腺,采集方法,男性尿道口分泌物：,先用生理盐水局部清洗，用无菌棉拭插入尿道口12cm，停留半分钟，轻轻旋转采集标本,女性阴道及宫颈口分泌物：则需在窥阴器下操作,用长的无菌棉拭采集分泌物,前列腺液：按摩,53,标本采集后应立即送检或放于保存液中置4,冰箱内保存（淋球菌培养除外）。,标本运送,54,创伤、组织、和脓肿标本,最好在抗生素使用之前采集标本。在创,伤出血时、敷用药物2h内及烧伤后12h,内不应采集标本,。,55,总体取材原则：取接近新生组织处的标本，既可以提高阳性,率，又能获得该部感染病原菌，中心部位的脓汁，由于营养,差，不利于细菌生长，阳性率低。开放部位的脓汁采集，应首,先用无菌生理盐水冲洗表面污染菌，然后挤压深部组织里的,脓汁进行培养。取组织进行培养最好。,1. 清创、消毒,2.大面积创伤：多部位采样,3.封闭性脓肿：无菌注射器抽取,4.开放性脓肿：无菌棉拭子采集脓液及病灶深部的分泌物，,5.瘘管：取组织碎片,6. 厌氧菌感染：应采集深部脓液并隔绝空气运送。排净注射器内空气，针头插入无菌橡皮塞送检,采集方法,56,伤口标本采集要求,1、,在伤口切开排脓时留取标本,2、不能在伤口清洁消毒后留取标本,3、尽量采集伤口深部的浓汁送检,57,组织或吸取物中革兰染色的评价,镜下所见,备注,出现鳞状上皮细胞,标本采集技术不过关，培养提示皮肤菌群污染,大量中性粒细胞,长时间仔细寻找病原菌，这时菌有可能在细胞内,大量的中性粒细胞，混合G-和G+小,细菌,混合厌氧或兼性厌氧菌感染,少见或可见破损的中性粒细胞和粗大,G不定的或G+b,可能是梭菌属细菌引起的组织坏死，手术应激，提示产期荚膜,梭菌引起的气性坏疽,中性粒细胞罕见，无其他体细胞,病人没能产生足够的免疫反应，或细菌没有能激活中性粒细胞,（如球菌），仍然高度怀疑细菌感染,细胞内微生物,活动性细菌感染,小的、浅的、不规则、链状排列G+c,呈堆排列,如果分离自脓肿,提示咽峡炎链球菌群(米勒链球菌),很细小G-b,特别是如果标本为淋巴结或组织时，这些菌可能为生物恐怖病,原菌（布氏杆菌，耶尔森菌，弗朗西斯菌），标本须在安全柜,里处理。平皿需用胶带封起来，培养物只能在生物安全柜中进,行。不可闻平皿。,58,脓液标本采集后应立即送检或存放于保存液中,。,标本运输,59,影响微生物检验的其它因素,标本容器是否合格,应该采用无菌、清洁、干燥、无溢漏的容器盛装标本，血液、骨髓、无菌体液等标本采用仪器法培养时，应将标本直接注入特定培养瓶中，但在注入标本之前，应该将瓶塞进行消毒。,60,根据标本的种类选择合适的容器。,厌氧菌培养，应将标本置厌氧环境容器中送检，以免厌氧菌接触空气死亡,61,送检时间,标本 采集后应立即送检，一般细菌培养送检时间不应超过 2小时，苛养菌应在30分钟内送检，否则，细菌死亡，导致培养结果阴性。对于客观条件限制，不能立即送检的标本，应用转运培养基保存标本送检。血培养标本应放置室温保存。,62,标本采集的量要符合标准,太少：捕捉细菌的几率少；太多：与培养基比例不适当，营养供给不足,不合格标本的处理,标本标识与申请单不一致；,采集的标本与申请单不一致；,非无菌容器留取的标本或采用不合格的容器；,63,容器中无标本；,将有菌容器的标本重新倒入无菌容器；,盛标本的容器未加盖；,取材后将标本放置时间过长；,64,换药后取材；,从输液管直接采集标本；,正在点滴抗菌药物过程中采集血液标本；,用注射器直接送检血液标本；,从尿液收集袋中直接抽取标本；,用拭子采集厌氧菌标本；,65,对于这些不合格的标本实验室应拒绝接受，在拒绝接受的同时，要及时通知临床医生或护士，说明标本采集不合格的原因，并给予正确指导。,66,血平板：适合于各类细菌生长,巧克力平板：含V、X因子,中国蓝平板或伊红美兰平板：弱选择性培养基,麦康凯平板：中等强度选择培养基,SS琼脂平板：强选择培养基,碱性琼脂或TCBS琼脂：弧菌,67,血液增菌培养基,营养肉汤,厌氧平板,68,标本接种,平板培养基在使用前应放孵育箱中烘干表面的水分，,取材,接种方式：不同的标本有不同的要求,培养环境：气体（氧气，CO,2，,）、厌氧、温度、湿度,培养时间,69,病原菌的选择及纯化,根据标本来源不同，选择有临床意义的病原菌，特别注意有正常菌群部位标本中病原菌的选择（如痰、咽、粪便标本）。将挑选出的细菌分纯、涂片后进行菌种鉴定,。,70,结果回报,审核：包括患者信息和检验结果及报告内容。,核对患者的信息资料：如姓名、性别、年龄、标本种类、检验项目等。,病人结果的确认：审核菌种和所测试的药敏结果，包括以下内容：,药敏结果与菌株鉴定是否一致,71,单个药敏结果与特定药物种类中活性规则层次是一致的（如三代头孢菌素对肠杆菌科细菌抗菌活性高于一、二代头孢菌素）。,分离株未被证明耐药及“仅有敏感”解释标准的药物是敏感的，如化脓性链球菌和无乳链球菌对万古霉素是敏感的；头孢噻肟和头孢曲松对流感嗜血杆菌是敏感的。,72,出现非常见或者不一致结果，应分析错误原因：,誊写错误,试剂污染,查找非常见或不一致结果原因，必要时重新进行菌种鉴定和药敏试验，可以考虑换一种试验方法。比如；氨苄青霉素耐药的肺炎克雷伯菌；青霉素耐药的化脓性链球菌等。,73,评论或修正,对于某些细菌或具有某些耐药表型细菌的药敏结果，其体外药敏试验可能与临床疗效不一致，应该给与评论或对其结果进行修正。,下列抗生素/微生物组合在体外可出现活性，但临床上无效，不应报告敏感：,74,产ESBL（超广谱,-内酰胺酶）肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌和奇异变形杆菌：对青霉素类、头孢菌素类和氨曲南不应报告敏感。,沙门菌属、志贺菌属：一、二代头孢菌素和氨基糖苷类不应报告敏感。,苯唑西林耐药的葡萄球菌属细菌：对所有青霉素类、头孢菌素类和其他-内酰胺类，如阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林/他唑巴坦和亚胺培南不应报告敏感。,肠球菌属：氨基糖苷类（除外高浓度）、头孢菌素类、克林霉素和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑不应报告敏感。,嗜麦芽窄食单胞菌：对于亚胺培南天然耐药,非发酵型细菌（如铜绿假单胞菌、不动杆菌）：对于一、二代头孢菌素耐药,75,与临床沟通,向临床医生了解患者的情况，对检验结果的判断有重要意义，如患者的症状体征、标本采集的部位、患者的用药情况等。,76,给临床医生一些建议，如在长期应用抗菌药物治疗过程中，有些细菌易发生耐药，对这类细菌应建议临床医生进行同一部位标本的重复测试。,这类细菌如下：,77,肠杆菌属、枸橼酸杆菌属和沙雷菌属,肠杆菌属、枸橼酸杆菌属和沙雷菌属在用3代头孢菌素长期治疗时，可以产生耐药，所以最初敏感株治疗3-4天后应建议临床医生重复进行实验,。,78,铜绿假单胞菌在用抗生素长期治疗过程中易产生耐药，在治疗34天后可耐药，应告知临床重复试验。,在长期应用氟喹诺酮治疗过程中葡萄球菌属易发展为耐药，所以在治疗34天后应重复测试,。,79,人有了知识，就会具备各种分析能力，,明辨是非的能力。,所以我们要勤恳读书，广泛阅读，,古人说“书中自有黄金屋。,”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识，,培养逻辑思维能力；,通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，,培养文学情趣；,通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。,有许多书籍还能培养我们的道德情操，,给我们巨大的精神力量，,鼓舞我们前进,。,