吸光光度法的灵敏度与准确度

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,吸光光度法的灵敏度与准确度,一,.,灵敏度的表示方法,:,摩尔吸光系数,(,),A=,b c,=A/bc,(Lmol,-1,cm,-1,),灵敏度越高,:,10,4,510,4,为中等灵敏度,;,10,5,为高灵敏度,;,10,4,*,选择性好,*显色剂在测定波长处无明显吸收。,对照性好,max,60 nm .,*,反应生成的有色化合物,组成恒定，稳定,。,*显色条件易于控制，,重现性好,。,8,8.4.2,显色条件的确定,c,(R),c,(R),c,(R),1.,显色剂用量,（,c,(M),、,pH,一定）,Mo(SCN),3,2+,浅红,Mo(SCN),5,橙红,Mo(SCN),6,-,浅红,Fe(SCN),n,3-n,9,2.,显色反应酸度,（,c,(M),、,c,(R),一定）,pH,1,pHpH,2,pH,10,邻二氮菲亚铁反应完全度与,pH,的关系,Fe,2+,+3R,H,H,A,柠檬酸,c,(R)R,=10,-4,molL,-1,3,10,21.3,3,FeR,3,11,pH3,8,为适宜,的酸度范围,12,3.,显色温度及显色时间,另外，还有介质条件、有机溶剂、表面活性剂等,T,1,(),T,2,(),t,(min),A,13,8.4.3,干扰及消除,Co,2,Fe,3+,Co,2+,FeF,6,3-,Co(SCN),2,(,蓝,),NaF,SCN,Co,2+,Fe,2+,Sn,4+,(2)Sn,2+,Co(SCN),2,SCN,测,Co,2,(,含,Fe,3+,) :,(,掩蔽法,),1.,化学法,14,Co,2+,Zn,2+,Ni,2+, Fe,2+,CoR,ZnR,NiR,FeR,CoR, Zn,2+,Ni,2+, Fe,2+,钴试剂,R,H,+,测,Co,2,:,(,生成络合物性质不同,),如不能通过控制酸度和掩蔽的办法消除干扰，,则需采取分离法。,测,Fe,3,:,(,控制,pH),Fe,3+, Cu,2+,FeSS,（紫红）,Cu,2+,pH 2.5,SS,15,2.,物理法,选择适当的测定波长,515,655,415,500,钍,-,偶氮砷,III,钴,-,亚硝基红盐,A,A,络合物,络合物,试剂,试剂,16,1.,仅络合物有吸收，,溶剂,作参比。,如,phen,Fe,2+,标准曲线,2.,待测液也有吸收,，,被测液,作参比。,如 测汽水中的,Fe,3.,显色剂或其他试剂也有吸收，,空白溶液,作参比,例,:,邻二氮菲光度法测,Li,2,CO,3,中的,Fe,，,参比溶液为不含,Li,2,CO,3,样品的所有试剂,。,4.,干扰组分与显色剂有反应,又无法掩蔽消除时：,1,）,掩蔽被测组分,，再加入显色剂，作参比,.,2,）,加入等量干扰组分,到空白溶液中,作参比,.,-,选择适当的参比溶液,17,8.5,吸光光度法的应用,1.,单一组分测定,1),金属离子,: Fe-phen, Ni-,丁二酮肟, Co-,钴试剂,2),磷的测定,: DNA,中含,P,9.2%, RNA,中含,P,9.5%,可得核酸量,.,H,3,PO,4,+12(NH,4,),2,MoO,4,+21HNO,3,=(NH,4,),3,PO,4,12MoO,3,+12NH,4,NO,3,+12H,2,O,磷钼黄,(,小,),磷钼,(V),蓝,(,大,),Sn,2+,18,3),蛋白质测定,溴甲酚绿、考马司亮蓝等,4),氨基酸测定,茚三酮,(,紫色化合物,),5),水质检测,: NH,4,+,、,NO,2,-,、,Mn,2+,、,Fe,2+,、,SO,4,2-,、,Hg,2+,-,6),药物含量测定,比吸光系数定量；荷移光谱法测定,.,7),紫外吸收,(UV): NO,2,-,、,NO,3,-,、,SO,4,2-,、,SO,3,2-,、,CO,3,2-,、,SCN,-,、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋白质等。,19,2.,多组分的测定,x,l,1,e,y,l,1,e,x,l,2,e,y,l,2,由,x,y,标液,在,1,2,处分别测得,在,1,处测组分,x,在,2,处测组分,y,b),在,1,处测组分,x;,在,2,处测总吸收,扣除,x,吸收,可求,y,c) x,y,组分不能直接测定,A,1,=,e,x,l,1,bc,x,+,e,y,l,1,bc,y,(,在,1,处测得,A,1,),A,2,=,e,x,l,2,bc,x,+,e,y,l,2,bc,y,(,在,2,处测得,A,2,),20,3.,光度滴定,NaOH,滴定 对硝基酚,p,K,a,=7.15,间硝基酚,p,K,a,=8.39,p,K,a,=1.24,V,1,V,2,V,(NaOH)/mL,对硝基酚,间硝基酚,酸形均无色,.,碱形均黄色,21,典型的光度滴定曲线,依据滴定过程中溶液吸光度变化来确定终点的滴定分析方法。,V,sp,滴定剂吸收,V,sp,被滴物吸收,V,sp,滴定剂与待测物均吸收,V,sp,产物吸收,22,4.,络合物组成的测定,(1),摩尔比法,:,固定,c,M,改变,c,R,1:1,3:1,c,(R)/,c,(M),A,1.0 2.0 3,0,23,(2),等摩尔连续变化法,:,M:R=1:1,0.5,0.33,c,M,/,c,c,M,/,c,M:R=1:2,24,表观形成常数的测定,(,设,M,、,R,均无吸收,),0.5,c,M,/,c,M:R=1:1,A,0,A,c,(M)=,c,(R)=,c,M,m,R,n,型,?,25,5.,一元弱酸离解常数的测定,p330,HL H,L,K,a,H,+,L/HL,高酸度下，几乎全部以,HL,存在，可测得,A,HL,HL,c,(HL),；,低酸度下，几乎全部以,L,存在，可测得,A,L,L,c,(HL).,代入整理：,HL,L,或,配制一系列,c,相同,pH,不同的溶液,测,A,.,26,MO,吸收曲线,A,a,(HL),A,b,(L),1,2,3,4,5,6,A,b,6,5,4,3,2,1,A,a,350,400,450,500,550,600,/nm,A,曲线,pH,1,1.10, 1.38,2,2.65,3,3.06,4,3.48,5,3.98,6,5.53,6.80,由每份溶液的一对,pH,、,A,，可求得一个,K,a,取平均值即可,.,27,MO,离解常数的测定,作图法,A,HL,3.32(p,K,a,),1,2,3,4,5,6,A,pH=p,K,a,pH,A,L,0.6,0.4,0.2,0,-0.2,-0.4,-0.6,3,.0,4,.0,pH,3.34,28,6.,双波长分光光度法消除干扰,(,不要求,),在,2,，,A,2,=,A,x,2,+,A,y,2,在,1,，,A,1,=,A,x,1,+,A,y,1,A,=,A,2,-,A,1,=,A,x,2,+,A,y,2,(,A,x,1,+,A,y,1,),=,A,x,2,A,x,1,= ,A,x,A,y,2,A,y,1,A,x,=(,x,2,x,1,),bc,x,消除了,y,的干扰,X,被测,Y,干扰,2,1,1,A,y,1,A,X,1,A,y,2,A,X,2,A,/nm,29,双波长分光光度法消除浑浊背景干扰,1,2,A,A,1,-,A,2,= ,A,Ac,例 牛奶中微量,Fe,的测定,30,7.,导数分光光度法,(,不要求,),A,图,混合物导数光谱,0,1,2,3,4,31,常药降压片中氢氯噻嗪含量的测定,1.,氢氯噻嗪,.,2.,硫酸双肼肽嗪,3.,盐酸可乐定,4.,常药降压片,250 290 330,4,1,2,3,1,2,A,32,肝中茚满二酮类抗凝血杀鼠剂的固相萃取,方法：肝匀浆用乙腈浸提，浸提液用,6,的,HClO,4,稀释，然后用,GDX100,大孔树脂萃取，用二氯甲烷,5mL,洗脱杀鼠剂，,40,挥干，剩余物用,0.1molL,-1,NaOH4mL,溶解后，紫外导数光谱测定。,A,0.0,c,d,a,b,D,a.,空白肝普通光谱,b.2.5 mg/L,敌鼠溶液的普通光谱,c.,空白肝二阶导数光谱,d.2.5 mg/L,敌鼠溶液的二阶导数光谱,33,8.1,了解分子对光的吸收与溶液颜色的关系,.,吸收曲线,定性分析的基础。,定量分析的基础,朗伯,-,比尔定律：,A=,bc,=-lg,T,式中各参数的物理意义，定量计算。,8.2,了解目视比色法、分光光度法的特点，分光光度计的基本部件。,8.3,灵敏度的表示,摩尔吸光系数的意义和计算,；,准确度,适宜的测量范围、偏离比尔定律的原因。,8.4,显色反应及条件的确定,:,显色剂用量、酸度、时间、温度、干扰及消除。,8.5,应用,:,单一组分测定示例、多组分测定、光度滴定、络合物组成的测定、酸碱离解常数的测定。,第八章 小 结,34,新年快乐！,35,