制药用水微生物检查方法的验证1

单击此处编辑母版文本样式,第二层,第三层,第四层,第五层,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二层,第三层,第四层,第五层,单击此处编辑母版标题样式,*,微生物检查方法验证,1,介绍内容,一、微生物的基础知识,二、微生物检查方法验证,2,微生物基础知识,微生物（,microorganism, microbe,）是一些 肉眼看,不见的微小生物的总称。,微生物（,microorganism,）包括细菌、支原体、螺旋,体、衣原体、立克次体、病毒及真菌霉菌、酵母菌和放,线菌）等。,3,微生物的特点,种类多 分布广,迄今为止，我们知道的微生物约有,10,万种，只占地球上,实际存在的微生物总数的,20%,。,4,微生物的特点,各体小，表面积大,物体的表面积和体积之比称为表面积， 大肠埃希菌,的表面积是人的,30,万倍。,5,微生物的特点,吸收多 转化快,如大肠埃希菌在合适条件下，每小时可以消耗相当于自身重量,2000,倍的数量，而人体则需要,40,年之久。,6,微生物的特点,适应强 易变异,多数细菌能耐,0,196,的低温；,硫细菌可在,250,300,的高温条件下正常生长；,一些嗜盐细菌甚至能在饱和盐水中正常生活；,产芽孢细菌和真菌孢子在干燥条件下能保藏几十,年、几百年。,7,微生物的类群和形态结构,微生物按其结构、化学组成及生活习性等分为三大类：,原核细胞型：细菌、放线菌、支原体、衣原体、立克次氏体、螺旋体等,真核细胞型：真菌,非细胞型：病毒 噬菌体,8,细菌的繁殖,细菌,（,bacterium,）属于原核细胞型微生物，其特点是具有细胞壁、原始的核质，以二分裂方式繁殖。,了解细菌的基本特性、细菌的鉴别，对新药的研发和防止药品污染，保证药品质量具有重要的意义。,9,细菌的形态,-,细菌体积微小，是无色半透明的，用肉眼直接观察难以看到，其结构和形状须经过显微镜放大数百倍至上千倍才能,观察。,-,一般以微米（,m,）作为测量单位。,-,在细菌学中，按其形态可分为球菌、杆菌、弧菌和螺杆菌。,经革兰染色法（,Gram stain,）可将细菌分成两大类：,革兰阳性菌（,G+,）和革兰阴性菌（,G-,）。,10,细菌的形态,11,细菌的形态,真菌（,fungus,；,eumycetes,）,是具有真核和细胞壁的生物。种类很多，已报道的种超过,10,万个。大多是由纤细管状菌丝构成的菌丝体。许多菌丝在一起统称菌丝体。菌丝体在基质上生长的形态称为菌落。,12,细菌的形态,真菌的形态具有多样性，大小不一，大的用肉眼可以看到，小的用普通光学显微镜放大数倍乃至千倍方可观察到。其形态分单细胞、多细胞，单细胞呈圆形或卵圆形，如酵母菌（,yeast,）。多细胞由菌丝和孢子组成，并交织成团。,13,药品污染常见的真菌,毛霉属、根霉属、曲霉属、青霉属、木霉属,-,毛霉属（,Mucor Micheli ex Fries,）毛霉属在自然界分布很广，常用于发酵工业。并引起水分高的粮食及食品的霉烂变质。,毛霉属的分枝类型,：,1.,单生（不分枝）,2.,总状分枝,3.,假轴状分枝,毛霉的孢子囊：,1.,孢子,2.,膜,3.,囊轴,4.,孢子囊柄,14,根霉属（,RhizopusEhrenberg,）,根霉属广泛应用于发酵工业，在潮湿的粮食及食品上能迅速蔓延生长，引起粮食及食品的腐烂。,根霉,A,：,1,营养菌丝,B,：,2.,匍匐菌丝,3.,假根,4.,孢囊柄,C,：孢囊放大图,1.,囊壁,2.,囊轴,3.,囊托,15,曲霉属（,Aspergillus,）,曲霉属的菌丝无色、淡色或表面凝聚有色物质，为有隔的多细胞。本属的常见产毒霉菌有,8,个种，具有强烈的致癌性。,曲霉,1,双层小梗分生孢子头,2.,单层小梗分生孢子头,3.,分生孢子梗基部足细胞,4.,双层小梗的细胞微结构,16,常见青霉分生孢子梗,青霉属,菌丝无色或有色，为有隔的多细胞。分生孢子梗从菌丝垂直生出，无足细胞，顶端不膨大，无顶囊，产生一轮至数轮分叉，在最后一级分枝的小梗上，长出成串的分生孢子，形似扫帚状，称为帚状枝。本属的常见产毒霉菌有,9,个种，其中展青霉可产生展青霉素，是一种神经毒素，并具有致畸、致突变和致癌性；,17,霉菌菌落形态,18,霉菌在孟加拉红培养基上的形态,19,酵母菌显微镜下形态,20,微生物检查法,微生物限度检查方法系检查非规定灭菌制剂及其原料、,辅料受微生物污染程度的方法。,检查项目包括 细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。,检查方法,多用平皿法、薄膜过滤法、涂抹法和,MPN,法，,国家药典规定应用经验证合格的方法。,21,检查方法的验证,试验环境,无菌检查应在环境洁净度,10 000,级下的局部洁净度,100,级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全,过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污,染的措施不得影响供试品中微生物的检出。,检验依据,单向流空气区、工作台面及环境应定期按,医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法,的现行国家标准进行洁净度验证。,-2010,版药典,22,隔离系统的应用,应用隔离系统重要的目的,-,是保护产品免受外源性污染，包括操作人员、操作环境及外包装等的污染，保证无菌实验结果的可靠性，实现一次检出的要求。,-,是保护操作人员免受实验过程中的有害物质带来的污染。,隔离系统,应按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度,须符合无菌检查的要求。,日常检验还需对试验环境进行监控。,23,-,为保证检验结果的可靠性，真实性，选择正确的检验方法,是至关重要的。因此试验前必须对选择的方法进行验证。,-,证明所采用的方法是适宜的，确认所采用的方法适宜于被,检供试品的微生物污染的检验。,方法验证的必要性,24,检验结果的影响因素,供试品的组分,抑菌剂、增溶剂、乳化剂及抗氧化剂，这 些,组分在一定浓度下对微生,物起一定的抑制作用也可对污染菌造成损伤。,环境影响,不同类型的微生物及不同的存活状态对环境的,抗性是不同的。,如培养基的质量、检验人员的操作误差等。,25,方法验证,试验全方面验证,如试验环境，培养基，供试液的制备，灭菌方法等全部进,行验证。,当验证试验符合要求时，就可认为在该试验条件下该供试,品对微生物无抑菌作用或抑菌作用可忽略不计，供试品检,验结果可真实的体现。,26,验证方法,菌液制备,50,100cfu/ml,。,验证方法,试验组、菌液组、供试品对照组、释剂对照组。,结果判断,供试品组、对照组、,稀释剂对照组的,菌回收率,均不低,70%,。,27,方法验证,验证方法,按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的,方法及下列要求进行。,对各试验菌的回收率应逐一进行验证。,验证试验至少应进行,3,次独立的平行试验，并分别计算,各试验菌每次试验的回收率。,28,方法验证,试验菌株,大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、 白色念珠菌、,黑曲霉、枯草杆菌。,菌液制备,同计数培养基的适用性检查。,29,方法验证,试验组,-,平皿法,取最低稀释级供试液,1ml,和,50,100cfu,试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基,(,平行制备,2,个平皿,),，按平皿法测定其菌数。,-,薄膜过滤法,取最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入,50,100cfu,试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。,30,方法验证,-,菌液组,所加的试验菌数。,-,供试品对照组,测定供试品本底菌数。,-,稀释剂对照组,用相应的稀释液替代供试品，加入试验,菌按试验组测定其菌数。,考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。,31,方法验证,试验组的平均菌落数,-,供试品对照组的平均菌落数,试验组的菌回收率,(,)=,X100%,菌液组的平均菌落数,稀释剂对照组的平均菌落数,稀释剂对照组的菌回收率,(,)=,X100%,菌液组的平均菌落数,32,谢谢,33,