病毒性传染病实验室诊断技术进展

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,分子生物学诊断技术进展,1,主要内容：,分子生物学诊断技术在病原学检测中的应用,简单介绍实验原理,以PCR、荧光实时定量PCR、NASBA为例,分子诊断技术在以下病原研究的应用进展,乙型肝炎,丙型肝炎,结核分枝杆菌,2,病原学检测常用的实验室技术,细胞培养与鉴定（“金标准”）、动物实验,血清学、免疫学诊断技术,电镜技术,分子生物学诊断技术,3,分子生物学诊断技术方法简介,4,分子诊断技术方法简介,2、多标靶同时检测,多重PCR,毛细管电泳,以测序分析为基础的检测技术,5,分子诊断技术方法简介,3、核酸杂交,DNA荧光原位杂交（FISH）,将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位。,线性探针分析法（LiPA）,杂交保护分析法（HPA）,4、质谱,利用色、质谱结合PCR技术,6,分子诊断的功能及扩展,病原的诊断和鉴别诊断,病原分型,病毒载量监测-个体化治疗的依据,疗效及预后标志,其他：病原感染中发生、发展各阶段,7,分子诊断的功能及扩展,疾病分型及意义,例如：HPV （30/100）,高危-16，18，31，45,低危- 6，11,8,分子诊断的功能及扩展,病毒载量与治疗,例1.,-北京地坛医院谢尧提供,9,分子诊断的功能及扩展,病毒载量与治疗,例2. HBV-干扰素,HBV100pg/mL 1/30 阴转,(HBeAg,HBeAb),10,分子诊断的功能及扩展,病毒载量与治疗,例3. HIV病毒载量与传播,15127人 流行病学调查415对伴侣,30个月HIV阳转22%（90/415）,51人RNA1500copies/mL 全阴,11,分子诊断的功能及扩展,病毒载量与治疗,例4. 血浆EBV载量与鼻咽癌复发,15个二年持续缓解： 0 copy/mL,10个复发：32250 copies/mL,17个随访：临床恶化前半年病毒载量升高,12,耐药病原的分子诊断,WHO：人类死亡1/3是长期用药的毒副作用,HBV的YMDD变异,HIV耐药,13,血制品筛查,300余万的血清阴性样品，分子生物学复测：,HBV：47,HCV：10,HIV-1：2,-2001年剑桥资料,HIV-1血清阴性而RNA阳性 0.2-6.6%,-Am. J. Chin Athol. 2000,14,在基础研究领域中的应用；,遗传病的基因诊断和产前基因诊断：,如血友病、地中海贫血等,肿瘤基因和肿瘤标志物表达,(mRNA),的检测；,骨髓移植、器官移植供体配型选择；,法医学、动植物学、古人类学、古生物学；,与疾病相关的各种蛋白（细胞因子、酶、激素、受体）的基因表达的检测；,药物基因组学、耐药基因的检测，等等,分子生物学技术在其它领域的应用,15,简单介绍实验原理,PCR,(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应),荧光实时定量PCR （real time PCR）,NASBA （依赖核酸序列的扩增）,16,PCR原理:,实质就是,体外基因复制技术,Mg,2+,dCTP,dGTP,dUTP,dATP,Taq,DNA聚合酶,AmpErase,Primer,靶序列,加热变性95,C,靶序列引物退火55,C,引物延伸72,C,17,PCR 循环,第一步 加热变性,靶序列,靶序列,从外周血白细胞或绒毛、羊水细胞提取的DNA约1ug，在含有适当缓冲液、引物、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP及dTTP）等的反应混合物中，在94下热变性1-4分钟，使之解为单链。,18,PCR 循环,第二步引物与靶序列退火,靶序列,靶序列,Primer 1,Primer 2,Biotin,Biotin,5,3,5,5,3,5,3,3,引物与解为单链的DNA上互补序列杂交在一起，称之为退火。55左右,19,PCR 循环,第三步 - 引物延伸,靶序列,靶序列,Primer 1,Primer 2,Biotin,Biotin,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq,DNA,Polymerase,在DNA聚合酶催化作用下，以dNTPs为原料（底物），从引物的3端A开始, 沿着53的方向，合成每条模板的互补链，此称引物延伸。72左右,20,第1个PCR循环完成后,靶序列,靶序列,Biotin,Biotin,21,30次循环后靶序列扩增的数量,No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target,12,24,38,416,532,664,201,048,576,301,073,741,824,1 cycle = 2 Amplicon,2 cycle = 4 Amplicon,3 cycle = 8 Amplicon,4 cycle = 16 Amplicon,5 cycle = 32 Amplicon,6 cycle = 64 Amplicon,7 cycle = 128 Amplicon,22,5,3,R,Q,探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，,所以检测不到荧光，此种现象称为,荧光共振能量转移。,荧光PCR原理 ,TaqMan,TM,技术,23,5,3,5,3,5,3,R,Q,Extension Step,5,3,1. Strand Displacement,Taq,3,Q,R,5,5,3,3,Q,Taq,R,5,2. Cleavage,3. Polymerization,Complete,5,3,Q,Taq,R,3,5,4. Detection,5,3,3,Q,Taq,R,5,l,R,荧光PCR原理 ,TaqMan,TM,技术,24,定量PCR测定的是扩增的指数扩增期;,定性PCR测定的是扩增的终点（平台期）,定量PCR与定性PCR测定的区别,25,市场上常见的实时荧光PCR仪,罗氏Lightcycler,MJ opticon2,伯乐icycler,ABI7000,杭州博日（原大和）linegene,26,临床标本,核酸提取技术,NASBA 扩增,ECL-化学发光标记检测,NASBA 扩增+分子灯塔检测,扩增过程中“分子灯塔” 即时同相检测,方法 1 - NucliSens ECL,方法 2 - NucliSens EasyQ,加入裂解缓冲液和内置标准,NASBA,测定原理,27,NASBA,扩增原理,引物 1,逆转录酶,RNase H,引物 2,逆转录酶,T7 RNA 聚合 酶,引物 2,逆转录酶,逆转录酶,RNase H,引物 1,线性循环,扩增循环,28,NASBA,和,PCR,的不同,NASBA,扩增目标为,RNA,同温扩增,连续扩增,扩增物为单链,RNA,引物次序不包含於最终产物中,PCR,扩增目标为,DNA,温度循环扩增,循环扩增,扩增物为双链,DNA,引物次序包含於最终产物中,29,乙型肝炎检测标志物：,HBsAg，抗-HBs,HBeAg，抗-Hbe,抗HBc (IgG,IgM),HBV-DNA,Dane颗粒（完整的病毒）形态,乙型肝炎的分子诊断,30,乙型肝炎的分子诊断,1. 重要性,全球 20亿人感染,慢性 3.5亿人,中国、东南亚、非洲50肝硬化，70-90肝癌,7-30携带者感染变异体,31,2. HBV基因型与血清型关系及流行病学分布,基因型与血清型不完全一致,临床突变率不同,有地域分布特点,乙型肝炎的分子诊断,32,表1：,基因型,血清学亚型,基因长度,(nt),临床突变率,主要,流行地域,PC*,(G1896A),BCP*,(1762/1764),A,adw2,ayw1,3221,6.5（少）,C1858,45（常）,西欧、北欧、北美、中非、印度,B,adw2,ayw1,3215,50（常）,T1858,16,东南亚、中国、日本,C,ayr;adrq+;,Adrq-;,adr;adw2,3215,50（常）,T1858或C1858,58（常）,东南亚、中国、日本、澳洲、美国,D,ayw2;ayw3;,ayw4,3182,43%(常）,T1858,12（低）,地中海、俄罗斯、印度、美国,33,表1,(续）:,基因型,血清学亚型,基因,长度,(nt),临床突变率,主要,流行地域,PC*,(G1896A),BCP*,(1762/1764),E,ayw4,3212,27（中）,7（低）,西非,F,ayw4;adw2;,Adw4q-,3215,16（少）,C1858,未定,中美、南美、波利尼西亚,G,Adw2,3248,100（高）,未定,中美、美国、法国、德国,H,adw4,3215,未定,未定,中美、南美、美国,PC*:前核心 BCP*:基本核心启动子 （科华生物 2004.07.21）,34,3. 基因型与临床,实验室表现不同（表2）,病情与转归：C较B差,抗病毒治疗：A优于D,B优于C,adw/ayw 20:1,乙型肝炎的分子诊断,35,表2:,36,4. 一般实验室分型方法,测序,PCR-RELP（限制性片断长度多态性）,PCR,核酸杂交（谱线探针法）,血清学：单抗可区分A-F各基因型,乙型肝炎的分子诊断,37,5. 抗病毒治疗的耐药性问题,拉米夫定耐药性的检测,乙型肝炎的分子诊断,38,拉米夫定耐药性的检测,耐药性与,HBV,多聚酶基因,YMDD,氨基酸序列中的核酸变异有关,I,型：,YMDD,变异为,HBV,聚合酶基因,(P,区基因,),区第,741,个核苷酸位,A-G,置换，使第,552,个密码子蛋氨酸,(M),被缬氨酸,(V),取代，成为,YVDD,变异,II,型：,YMDD,变异为,P,基因区,743,个核苷酸的,G-T,置换，使第,55,个密码子蛋氨酸,(M),被异亮氨酸,(,工,),取代，成为,YIDD,变异,YMDD,变异：,Y,（,酪氨酸）,M,（,蛋氨酸）,V,（缬）：,YVDD,变异,D,（,天冬氨酸）,I,（异亮）：,YIDD,变异,D,（,天冬氨酸）,最近报道：,Y,S,DD,（,ATG,AGT,）,应用拉米夫定耐药位点基因芯片检测突变位点,乙型肝炎的分子诊断,39,乙型肝炎的分子诊断,40,乙型肝炎的分子诊断,41,HCV,的基因型/亚型,6个型，68个亚型,1a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m,2a, b, c, d, e, f, g, h, i, k, l, m,3a, b, c, d, e, f, g, h, i, k,4a, c, d, e, f, g, h, k, l, m, n, o, p, q, r, s, t,5a,6a, b, d, f, g, h, i, j, k, l, m, n,丙型肝炎的分子诊断,42,HCV基因分型方法,测序,型特异性引物,PCR,分型法,线性探针杂交（,InnoLipa,),限制性片段长度多态性分析（,RFLP,）,TRUGENE HCV 5NC Genotyping Assay,丙型肝炎的分子诊断,43,5UTR (5Non-Coding Region),高度保守,HCV RNA诊断实验的常用区域,有一套良好的多态性特征，因此可用于基因分型,许多HCV分型商业试剂盒都采用该区进行分型,TRUGENE HCV 5NC Genotyping Assay,VERSANT HCV Genotyping Assay (LiPA),HCV NS5B区,各亚型间基因差异较大,扩增效率较低,若成功扩增，序列分析可区别HCV各亚型。,HCV基因分型常选用的区域,丙型肝炎的分子诊断,44,临床工作,目前常用的基因型检测方法（RFLP, InnoLipa, Trugene) 通常建立在5非编码区，因为该区序列保守，检测灵敏度高，是HCV RNA诊断实验的常用区域。,在临床工作中，对5UTR进行分型的RFLP, InnoLipa, Trugene分型都可以满足分型的需要，为制定治疗方案和判断预后提供指导。,常只需将1型和4型与其它基因型相区别，以决定抗病毒治疗的疗程和利巴韦林的剂量，因此上述的任何一种方法均可以采用。,丙型肝炎的分子诊断,45,HCV 5UTR gene,Second PCR product=257bp,Scheme A,Cleavage with BsrB,Hinfand Hae,93 and 91bp,Genotype 2a and 2b,257bp,Genotype 3b,4a and 5a,127 and 91bp,104,74bp,160,74bp,2a,2b,160,74bp,234bp,3b,4a and 5a,Cleavage with Hae,Scheme C,Cleavage with Apo,183,74bp,257bp,4a,1b,197bp,Genotype 1a,1b and 6a,166/169 and 91bp,Cleavage with BstU,Scheme B,1a,227bp,5a,Genotype,3a,6a,257bp,HCV 5非编码区ABC程序复合酶切分型法流程图,-北京大学人民医院肝病研究所提供,46,抗HCV的确认实验,确认的重要性（灰区的遗漏）,目的：解决血液筛查实验（如ELISA）的非特异性问题,方法：,例如：,PCR,活动性病毒血症的检测是一个很好的检测方法,RIBA 3.0,抗体的确认,新流程：,丙型肝炎的分子诊断,47,抗-HCV筛查检测,报告,阴性,或,根据S/Co比值判定为阳性,所有阳性结果,高S/Co比值阳性*,报告,低S/Co比值阳性*,RIBA HCV检测,或,阳,性,报告,阴,性,报告,不,确,定,报告,阳性,阴,性,RIBA HCV检测,HCV RNA的NAT检测,阳,性,报告,阴,性,报告,不,确,定,报告,报告,*以S/Co 3.8 (OCD HCV ELISA 3.0) 或 8.0 (OCD VITROS ECi/ECiQ HCV)为“界值”。,CDC抗-HCV实验室检测结果报告导则,48,靶序列来源:,a. 单抗检出的TB抗原蛋白编码基因,b. TB特异性核酸片段克隆,c.,插入序列,结核分枝杆菌(TB),的分子诊断,TB 检测,实验设计特点,49,65KD，165bp;,MPB64，240bp;,IS6110，123bp;,IS986，245bp;,16sDNA，584bp.,举例,结核分枝杆菌(TB),的分子诊断,TB 检测,50,标本处理 ：痰液化，抑制物去除,试剂质控及灵敏度,注意事项,结核分枝杆菌(TB),的分子诊断,TB 检测,51,结核的PCR临床主要应用,a.结核与其他分枝杆菌区分,b.结核耐药基因,c.对含菌量低的标本的分离,d.为临床可疑者捕捉信息,临床评价,结核分枝杆菌(TB),的分子诊断,TB 检测,52,PCR方法与痰涂片及TB培养的比较,应做比对研究,临床评价,结核分枝杆菌(TB),的分子诊断,TB 检测,53,RFP（利福平）,INH（异烟肼）,SM（链霉素）,EMB（乙胺丁醇）,PZA（吡嗪酰胺）,喹诺酮类,已确定的耐药的抗结核药物,结核分枝杆菌(TB),的分子诊断,耐药监测,54,单耐药基因检测,耐利福平：,突变一般发生在RNA聚合酶B亚单位编码基因（rpoB基因）,突变位点：531位 丝氨酸,亮氨酸,526位 组氨酸,酪氨酸,突变导致RFP 不能与RNA聚合酶B亚单位结合,耐异烟肼：,与三种基因突变有关,katG基因（突变位点：463位 精氨酸,亮氨酸）,inhA基因（突变位点：94位 丝氨酸,丙氨酸）,ahpC基因,结核分枝杆菌(TB),的分子诊断,耐药监测,55,同时对利福平、异烟肼这两种或以上的抗结核药物耐药,大多数耐多药菌株是各种药物作用靶分子的编码基因逐步突变所致; 靶结构变化与耐药水平有关,少数耐多药菌株是由一个耐多药位点的突变所致,耐多药基因检测,结核分枝杆菌(TB),的分子诊断,耐药监测,56,样品的制备,PCR扩增已知的与耐药有关的基因片段,扩增产物耐药基因分析,SSCP（单链构象多态性分析）,RFLP（限制性片段长度多态性分析）,DNA序列分析,耐药基因的检测方法,结核分枝杆菌(TB),的分子诊断,耐药监测,57,需面对的问题,高费用,感染与患病,与传统医学的矛盾,技术本身的缺陷（污染、生物安全）,58,其它需要关注的问题：,标本采集、运送和保存,：,供分离病毒、检出核酸及抗原的标本，要求做到：,1.早：特别是对用于病毒分离、抗原或核酸检测的标本。,2.快：病毒离活体后在室温下很易死亡，故采得标本应尽快送检。不能及时检测的标本应放入装有冰块或干冰的容器内送检。短时间可低温保存，冻存的标本忌反复冻融。,3.近：用于病毒分离、抗原或核酸检测的标本应尽量取自病变部位或接近病变部位(如脑炎取脑脊液，腹泻取粪便，呼吸道感染取鼻咽分泌物或支气管灌洗液，有病毒血症时采取血液)。,4.多：标本的量不能太少，如有可能一次取多种标本，在病程急性期和恢复期都取标本。,5.净：避免污染标本，特别是用于病毒分离或PCR检测的标本,实验室生物安全保护,实验室室内、室间质量控制,59,谢 谢,2007年11月,60,