microRNA解读

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,micro RNA,microRNA,的出现,1993,年，,Ambros,首先在,Cell,杂志上撰文发现了一段非编码的单链小分子,RNA,，具有调解发育时相的作用，这是对,microRNA,的首次报道。,近年来，,Cell/Nature/Science,连续把,RNA,的研究进展列为,“,十大科技突破之一,”,，其中,最引人注目,的是,microRNA,。,什么是,microRNA,?,MicroRNA,(,miRNA,),是一类内生的、长度约,20-24,个核苷酸的小,RNA,，其在细胞内具有多种重要的调节作用。,关于,microRNA,的一些研究,最近的研究表明大约,70 %,的哺乳动物,miRNA,基因是位于,TUs,区,( transcription units ,TUs,) ( Rodriguez et al ,2004) ,且其中大部分是位于内含子区,( Kim &Nam , 2006),。一些内含子,miRNA,基因的位置在不同的物种中是高度保守的。,miRNA,不仅在基因位置上保守,序列上也呈现出高度的,同源性,(,Pasquinelli,etal, 2000 ;,Ruvkun,et al , 2001 ; Lee &,Ambros,2001),。,miRNA,高度的保守性与其功能的重要性有着密切的关系。,miRNA,与其靶基因的进化有着密切的联系,研究其进化历史有助于进一步了解其作用机制和功能。,什么是同源性？,进化过程中源于同一祖先的分支之间的关系。,由于进化上或个体发育上的共同来源而呈现的本质上的相似性，但其功能不一定相同，如狗的前肢和鸟的翅。,从分子水平讲则是指两个核酸分子的核苷酸序列或两个蛋白质分子的氨基酸序列间的相似程度。,虽然同源性须通过序列测定来检验，但是,DNA-DNA,或,DNA-RNA,杂交可提供有价值的估计,。,microRNA,的存在形式,MicroRNA,存在多种形式，最原始的是,pri-miRNA,，长度大约为,3001000,个碱基；,pri-miRNA,经过一次加工后，成为,pre-,miRNA,即,microRNA,前体，长度大约为,7090,个碱基；,pre-,miRNA,再经过,Dicer,酶,酶切后，成为长约,2024nt,（,nt,=,核苷酸,nucleotide,）的成熟,miRNA,。,Dicer,酶,是,RNase,III,家族中特异识别双链,RNA,的一员，它能以一种,ATP,依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链,RNA,，切割将,RNA,降解为,19-21bp,的双链,RNAs(siRNAs,),，每个片段的,3,端都有,2,个碱基突出。,microRNA,的特征,已经被鉴定的,miRNAs,据推测大都是由具有,发夹结构,，约,70,个碱基大小形成发夹结构的单链,RNA,前体经过,Dicer,酶加工后生成的，有,5,端磷酸基和,3,羟基，大小约,21,25nt,的小分子,RNA,片断，定位于,RNA,前体的,3,端或者,5,端。,什么叫发夹结构？,发夹结构（,hairpin structure,）：,RNA,是单链线形分子，只有局部区域为双链结构。这些结构是由于,RNA,单链分子通过自身回折使得互补的碱基对相遇，形成氢键结合而成的，称为发夹结构。,microRNA,的功能,对一部分,miRNAs,的研究分析提示：,miRNAs,参与生命过程中一系列的重要进程，包括早期发育（,Reinhart 2000,），细胞增殖，细胞凋亡，细胞死亡（,Brennecke,2003,），脂肪代谢（,Xu,2003,）和细胞分化（,Kawasaki 2003,）。,此外，一个研究表明，,2,个,miRNAs,水平的下降和慢性淋巴细胞白血病之间的显著相关，提示,miRNAs,和癌症之间可能有潜在的关系（,Calin,2002,）。,然而，大多数的,miRNAs,的功能仍然是个迷。,microRNA,的作用方式,最早发现的两个,miRNAs,lin-4 and let-7,被认为是通过不完全互补结合到目标靶,mRNA 3,非编码区端，以一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制，进而抑制蛋白质合成，阻断,mRNA,的翻译。,多个果蝇,miRNAs,也被发现和他们的目标靶,mRNAs,的,3,非编码区有部分同源。由于,miRNAs,和其潜在的目标靶之间并非完全互补，这使得通过信息学的方法鉴定,miRNA,的目标靶位点变得困难。因而也无法确定,miRNAs,的作用方式是什么，以何种机制影响,mRNA,的翻译，以何种方式调控基因表达。,miRNAs,的作用目标靶和活性机制一直是各地的研究人员的关注热点。,研究,microRNA,的新工具,小分子,RNA,的分离：现行的,RNA,纯化方法包括有机溶剂抽提,+,乙醇沉淀，或者是采用硅胶膜离心柱的方法来纯化,RNA,。小分子,RNA,往往被淘汰掉，因而不适用于小分子,RNA,。,miRNA,Isolation Kit,主要采用,玻璃纤维滤膜离心柱,（,glass fiber filter,，,GFF,）方法分离。,小分子,RNA,探针的制备,：要准备目的基因的一小段寡核苷酸序列，,3,s,端另外增加,8,个和,T7,启动子互补的碱基，将这段寡核苷酸和,T7,启动子引物退火，用,Klenow,大片断补齐得到双链的转录模版，然后用,T7 RNA,聚合酶、,rNTP,和标记物混合，体外转录得到标记的小分子,RNA,探针。,研究,microRNA,的新工具,小分子,RNA,的检测,;,由于小分子,RNA,是一类很小的分子，部分小分子,RNA,表达水平可能很低，因而需要极为灵敏而定量的分析工具，由于其分子很小，用,RT-PCR,的方法来定量研究非常困难。,目前多数采用,Northern Blots,一种技术复杂而费力的方法。改进新方法：将同位素标记好的小分子,RNA,探针和待检测样品混合杂交，未杂交的,RNA,和多余的探针用单链核酸酶消化，然后使核酸酶失活，并纯化杂交的,RNA,分子，最后通过变性胶电泳放射自显影检测结果。,Thanks a million,