原发性开角型青光眼MYOC基因C1009缺失突变致病机理的研究课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,原发性开角型青光眼,MYOC,基因,C1009,缺失突变致病机理的研究,谢小兵,湖南中医药大学第一附属医院,湖南 郴州,2012,年,8,月,内容纲要,一、青光眼概述,二、原发性开角型青光眼突变,基因筛查,三、青光眼致病机理研究,-,基因功能研究（,细胞,/,动物水平,）,一、青光眼概述,疾病基本特征：,病理性高眼压、视神经萎缩、视盘凹陷扩大及进行性视野缺损,（视力减退）。,病因,：,尚不清楚，一般认为是由多种因素引起,。,现认为主要是由遗传和环境因素相互作用所致,。,发病情况：,是世界上第二大致盲性眼病,，仅次于白内障。其分类有多种，其中近一半为原发性开角型青光眼（,primary open angle glaucoma,，,POAG,）,。,2010,年全世界有,6000,多万人患有,POAG,，其中有,450,万人会失明。,原发性,继发性,开角型,闭角型,病因学,前房角,发病年龄,婴幼儿型,青少年型,成人型,前房的位置,房水循环示意图,开角型青光眼示意图,闭角型青光眼示意图,前房形态,瞳孔,睫状,肌,后房,前房,前房角,小梁网,（,Schlemm,）,集液管,房水静脉,施莱姆氏管,正常房水循环途径,青光眼的遗传倾向：,大量的家系调查发现，约,13%,47%,的开角型青光眼具有家族史，开角型青光眼发病率为,2.8%,16.4%,，远,高于,正常群体的发病率。,青光眼的相关致病基因,：目前至少发现,7,条染色体与,POAG,相关,。,MYOC,基因是最先确定的与,POAG,相关的致病基因。,1,号染色体：,MYOC,基因：,图,1,1,号染色体结构及,MYOC,基因结构图,1q24,25,已报道的与,POAG,有关的致病性,MYOC,基因突变,二、突变基因的筛查,（一）大型原发性开角型青光眼家系调查：,1.,该家系共,56,人，其中男性,27,人，发病,7,人，女性,29,人，发病,4,人。,2.,MYOC,基因突变筛查 ：,RFLP,、,SSCP,法筛查,3.,突变蛋白二级结构分析及统计学分析,研究发现在不同地区不同种族,POAG,的,MYOC,基因突变现象并不相同,，,MYOC 90%,的基因突变位于第,3,个外显子,。目前,较肯定的与青光眼发病有关的突变有,:,Tyr437His,（,human),、,Tyr423His(mouse),、,Pro370Leu,、,Glu337Arg,、,Gly357Val,等,。,1. Transgenic Mice Expressing the Tyr437His Mutant of Human,Myocilin,Protein Develop Glaucoma,Invest,Ophthalmol,Vis Sci,. 2008 May ; 49(5): 19321939.,2.,Expression of Mutated Mouse,Myocilin,Induces Open-Angle Glaucoma in Transgenic Mice,The Journal of Neuroscience,. November 15, 2006, 26(46):1190311914,实验分组：,1.,青光眼,家系组,(56,人）,2.,正常,对照组,（,200,例）,入选标准：, 体检健康者；, 年龄,2060,岁；, 无青光眼家族史；, 眼底及眼压检查正常者。,突变筛查：,2,琼脂糖凝胶电泳检测产物条带,DNA,的提取：外周血用改良,NaI,法提取模板,DNA,PCR,扩增：,引物设计：,MYOC,第一外显子,：,6,对引物；,PCR,产物分别命名为,MYOC 1,6,；,MYOC,第二外显子,：,1,对引物；,PCR,产物命名为,MYOC 7,；,MYOC,第三外显子,：,6,对引物；,PCR,产物分别命名为,MYOC 8,13,。, 产物鉴定：,PCR,产物酶切及突变分析：,PCR-RFLP,法共筛查,了分布于,MYOC,基因三个外显子的,13,个点突变，,酶切产物经,8,PAGE,鉴定。,氨基酸,改变,碱基,改变,PCR区段,限制性,内切酶,酶切片段（bp）,结果,Pro13Leu,C38T,MYOC 1,Asu,I,未突变,突变,155,19,174,5例可疑,Arg46Term,C136T,MYOC 2,BsuR,未突变,突变,118,78,196,无异常,Gln48His,G144T,MYOC 2,BseN,(Bsr),未突变,突变,69,127,196,无异常,Arg76Lys,G227A,MYOC 3,Alw261,(BsmA),未突变,突变,93,96,189,3例可疑,Asp208Glu,C624G,MYOC 7,Alw261,(BsmA),未突变,突变,57,177,57,77,100,无异常,Gly246Arg,G736A,MYOC 8,BseL,(BsiY),未突变,突变,48,129,177,无异常,ln337stop,C1009del,MYOC 10,Bme1390,未突变,突变,56,61,73,56,134,12,例可疑,Ile345Met,A1036G,MYOC 10,Pag,(BspH),未突变,突变,190,84,106,无异常,Pro361Ser,C1081T,MYOC 10,Bme1390,未突变,突变,56,61,73,6,129,无异常,Gly367Arg,G1099A,MYOC 10,BseD,(Sec),未突变,突变,8,15,42,53，72,8,53,57,72,无异常,Asp380Asn,G1138A,MYOC 11,Tru1,未突变,突变,197,49,148,无异常,Ile477Ser,T1430G,MYOC 13,NmuC,(Tsp45),未突变,突变,73,106,53,53,73,无异常,Pro481Leu,C1442T,MYOC 13,Mnl,未突变,突变,25,154,25,74,80,无异常,所筛查的突变位点及酶切结果,具体酶切结果如下：,1. MYOC 1,片段全长,174bp,，检测出了一个位于第一外显子的新的点突变,38CT,。未突变片段存在限制性内切酶,Asu,I,的酶切位点，,突变后则该酶切位点消失,。经该酶消化完全后，可见明显的杂合子条带。该突变存在于家系的,4,例已确诊病人和,1,例可疑者中，在对照组中未检出,。,MYOC 1,片段,Asu,I,酶切结果图,1,：家系病人（,C,T,）杂合子）,2,：正常对照组,3,：,PCR,产物,M,：,DNA marker,2. MYOC 3,片段全长,189bp,，未发生突变时有一个,Alw261,酶切位点，酶切后片段为,93bp,和,96bp,，若发生突变则酶切位点消失。经酶切，发现酶切后片段为,93bp,、,96bp,和,189bp,者,3,例，为杂合子，由于,93bp,和,96bp,两条片段只相差,3bp,，在,8%,的,PAGE,上分辨率比较低，只能观察到重叠影,。证实发生了,G227T,突变。,MYOC 3,片段,Alw261,酶切结果图,1,：杂合子,2,：纯合子,3,：,PCR,产物,M,：,DNA Marker,3. MYOC 10,片段全长,190bp,，未发生突变时有,2,个,Bme1390,酶切位点，酶切后片段为,56bp,、,61bp,和,73bp,，若发生,1009,位点突变，则酶切后片段为,56bp,和,134bp,。经酶切，发现酶切后片段为,56bp,和,134bp,者,2,例，片段为,56bp,、,61bp,、,73bp,和,134bp,者,10,例，存在,1009,位点,C,碱基缺失,突变,。,MYOC 10,片段酶切结果图,1,：杂合子,2,：未突变产物,3,：纯合子,4,：,PCR,产物,M,：,DNA,Marker,阳性,PCR,产物测序结果,将根据酶切筛选出的异常结果进行双向测序，测序表明在,38,位点,C,变为,T,，,227,位点,G,突变为,A,，在,1009,位点发生,C,碱基缺失,。,C,38,T,（,Pro,13,Leu,）测序图,（箭头所指为杂合子双峰,）,G,227,A(Arg,76,Lys),测序图,C,1009,del,(Gln377,stop,),测序图,PCR,产物测序结果,统计学分析,在该,56,人的家系中，,227GA,、,C1009del,和,38CT,三种突变筛选情况如下表：,家系中三种突变的筛选情况,突变,确诊,(,例）,表型正常（例）,合计 （例）,正常对照组 （例）,227GA,2,1,3,0,C1009del,11,1,12,0,38CT,4,1,5,0,结论,1.,本研究在,POAG,家系中，共发现,MYOC,基因三个突变,分别是,G227A,、,C1009del,和,C38T,其中后两个突变为首次发现。,2.,G227A,突变,者,3,例，其中,2,例为已确诊的,POAG,病人,1,例为家系中表型正常人，对照组中未发现,3.,C1009del,突变,者,12,例，其中,11,例已经确诊,POAG,在,1,例,4,岁的子代亲属中也发现该突变。正常对照组中未发现,4.,C38T,突变,存在于,4,例已确诊的,POAG,病人和,1,例可疑者中，正常对照组中未检出。,这三个,突变,的发病率,在家系组和,正常对照有统计学意义。,C1009del,FJ237047,（二）,蛋白结构的生物信息学分析,进行蛋白质结构分析,（,蛋白质分析软件,Antheprot4.3,）,蛋白质一级结构分析 ：,1.,第,227,位点的碱基改变,GA,导致第,76,位氨基酸由精氨酸变为赖氨酸（,Arg76Lys,）,。,G,227,A,（,Arg76Lys,）突变前后氨基酸序列对比,2.,第,1009,位点的,C,碱基缺失,(C1009del),导致终止密码子提前出现,C1009del,突变前后氨基酸序列对比,C38T,突变前后氨基酸序列对比,3.,对,38,位,C,碱基突变为,T,碱基，导致第,13,位氨基酸由脯氨酸变为亮氨酸,。,G227A,（,Arg76Lys,）突变前后蛋白质二级结构预测（,DMP,法,）,蛋白质二级结构预测分析,1. G227A,（,Arg76Lys,）突变前后，蛋白质结构未发生明显变化,C1009del,突变前后蛋白质二级结构预测（,DMP,法）,2. C1009del,突变前后蛋白质二级结构发生了较大变化,C38T,突变前后蛋白质二级结构预测对比（,DMP,法）,3. C38T,突变前后：,导致蛋白质的氨基酸序列发生了改变（脯氨酸亮氨酸），但并未造成蛋白质的,-,螺旋、,-,折叠、,-,转角和无规则卷曲等二级结构的明显改变,。,G227A,（,Arg76Lys,）突变前后蛋白质理化特性曲线,蛋白质理化特性分析,分析结果：突变前后,蛋白质的抗原性、亲水性、疏水性、溶解性等理化性质都未发生明显改变,C1009del,突变前后蛋白质理化特性曲线,分析结果：,蛋白质的抗原性、亲水性、疏水性、溶解性等理化性质都发生了较大变化,。,C38T,突变前后蛋白质理化特性曲线对比,分析结果：,蛋白质的抗原性、亲水性、疏水性、溶解性等理化性质未发生明显改变。,结论,1.,蛋白质的一级结构分析结果显示,G227A,突变,Arg76Lys,；,C1009del,导致氨基酸发生,移码,突变,；,C38T,突变,Pro13Leu,2.,蛋白质二级结构分析结果显示,G227A,突变前后和,C38T,突变前后，蛋白质的结构和性质未发生明显改变，而,C1009del,突变前后,，,蛋白的,物理,性质发生了明显,变化，这些性质变化可能影响了蛋白之间的相互反应，可能与青光眼的发生相关。,MYOC,基因突变致病机理？,青光眼发生的分子机制？,青光眼,房水循环,三、转基因细胞水平功能研究,（一）,RNA,干扰技术对,MYOC,基因,C1009del,突变小梁细胞模型的构建,流程,1,、目的基因,RNA,干扰慢病毒载体制备,针对,目的基因,靶序列，利用公用网站按照,RNA,干扰序列设计原则，设计多个,RNA,干扰靶点序列，选择最,佳,靶点；,阳性克隆质粒抽提：,琼脂糖凝胶电泳图,：,1,号泳道：,marker,；,10 kb,，,9 kb,，,8 kb,，,7 kb,，,6 kb,，,5 kb,，,4 kb,，,3 kb,，,2 kb,，,1Kb,，,900 bp,，,750 bp,，,600 bp,，,500 bp,2,、,3,、,4,、,5,号泳道分别代表,psc-1,、,psc-2,、,psc-3,、,psc-4,质粒载体；,6,号泳道代表,pscNC,（普适性阴参对照）质粒载体。,2,、目的基因过表达载体构建,1#,：阴性对照（,ddH2O,）,2#,：阴性 对照（空载组）,3#,：阳性对照（有确定插入片段的载体组）,4#,：,Marker,：,5 kb,，,3 kb,，,2 kb,，,1.5 kb,，,1 Kb,，,750 bp,，,500 bp,，,250 bp,，,100 bp,。,5#-10#,为,pEGFP-N1-MYOC,PCR,鉴定阳性克隆,使用,293T,细胞检测融合基因是否表达,因真核表达载体,pGFP,N1,上含有绿色荧光蛋白,GFP,的基因，当重组融合基因成功转染进入,293T,细胞后，如果融合基因能够表达，则绿色荧光蛋白也被翻译，从而细胞在荧光显微镜下可显示绿色荧光，故可通过观察绿色荧光的有无来判断融合基因是否表达。,荧光镜检与白光镜下结果 ：,293T,细胞荧光镜检结果,293T,细胞白光镜检结果,阳性克隆测序,3,、,Western Blot,筛选,RNAi,有效靶点,构建好含有目的基因的,过,表达克隆质粒和针对靶基因不同干扰靶点的,RNAi,病毒载体质粒,，,共转染培养好的工具细胞（即,293T,细胞），转染,24h,荧光显微镜下观测转染效果，转染,36,48h,收集细胞抽提蛋白，采用,Western blot,检测目的蛋白的表达情况，进而判断不同靶点的干扰效果。,Western Blot,结果扫描,（第一次实验的,knockdown,检测）,Western Blot,结果扫描,（第二次实验的,knockdown,检测）,注释：,PC,：加入,pcDNA3.1,质粒；,NC1,：对照组,1,，不含干扰靶点的敲减质粒；,NC2,：对照组,2,，含有紊乱序列的敲减质粒；,1,，,2,，,3,，,4,：含有不同干扰靶点的敲减质粒；,0.5g,，,1.0g,：加入的质粒量,（,1,）,293T,细胞共转染实验,（,2,）,Western Blot,检测目的基因表达水平,结,论,本实验通过设计并构建,4,个针对目的基因的,4,个干扰质粒，通过两次筛靶实验的结果可以看到，,1#,，,2#,和,3#,对,MYOC,有敲减作用,，在两个质粒浓度下的作用基本是一致的。此外，,4#,也有一些作用，特别是在高浓度下，,随机,选择,3#,干扰靶点,(PSC 413),进行慢病毒大量包装。,4,、,检测小梁细胞,MYOC,基因,Knock Down,效率,细胞总,RNA,抽提：,RNA,逆转录获得,cDNA,Real-time PCR,检测,定量,PCR,扩增曲线第一次,定量,PCR,扩增曲线,-,第二次,结果统计图,-,第一次,结果统计图,-,第二次,注：,CON:,未感染任何病毒的小梁细胞；,KL376:,感染过表达,MYOC,慢病毒的细胞；,KL376+NC:,阴性对照；,KL376+KD:,感染针对,MYOC,的,RNAi,慢病毒的细胞,。,统计学分析,Western blot,检测,KD,效率,准备靶细胞,慢病毒感染靶细胞,提取感染靶细胞的总蛋白,Western blot,从图可见在,90KD,处出现阳性条带。认为该条带就是目的蛋白的条带。,该图显示：靶点感染组（标注为,413,）相对阴,性对照组（标注为,NC,），阳性条带更弱，表明靶点组目的蛋白表达水平下调。因此,psc413,是有效的,RNAi,靶点。,（,CON,：,未感染过表达,MYOC,病毒的小梁细胞）,无条带，细胞,本底基本不表达,MYOC,基因，成功构建了小梁细胞模型。,（二）,MYOC,基因,C1009del,的定点突变,定点突变技术是蛋白质工程中采用的重要技术之一，它是在已知基因的预定位点通过替换、插入或缺失一定长度的核苷酸片段，精确地改变基因的特定碱基序列，从而研究基因表达调控机制及蛋白质结构与功能的关系，从微观水平上阐述正常状态下基因调控机理及与疾病的关系。,1,、构建青光眼相关基因,MYOC,的,C1009del,突变,（,1,）,感受态细胞的制备,（,2,）,MYOC,基因,C1009del,突变质粒载体的构建,对阳性菌落的基因用引物,EGFP-N-R,进行测序分析，其测序结果如下：,测序结果显示成功完成了,MYOC,基因,C1009del,的定点突变,（,3,）,阳性重组体转化入感受态细胞,2,、小梁细胞的培养,小梁细胞：来源于本实验室液氮中的保种细胞。,用,G418,进行细胞筛选,G418,一种氨基糖苷类抗生素。在分子遗传实验中,是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。,当,neo,基因被整合进真核细胞,DNA,后,则能启动,neo,基因编码的序列转录为,mRNA,，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有,G418,的选择性培养基中生长。,G418,的这一选择特性，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。,正常生长的小梁细胞,（未用,G418,筛选前）,阴性对照细胞,（未导入突变基因）,含,300l/ml G418,的培养基,中的细胞形态,含,400l/ml G418,的,培养基中的细胞形态,含,500l/ml G418,的培养基,中的细胞形态,含,700l/ml G418,的培养基,中的细胞形态,小梁细胞：来源于本实验室液氮中的保种细胞。,利用不同浓度的,G418,筛选,10,天后的单个视野中小梁细胞,在第,14,天时观察细胞长势，发现,G418,终浓度,：,400l/ml,，,小梁细胞全部凋亡，看不到贴壁细胞,；,=300l/ml,，,尚有贴壁存活的小梁细胞,。,因此，,决定,400l/ml,的,G418,浓度作为后续筛选导入突变基因的小梁细胞的浓度。,四、,动物水平基因功能研究,（一）转基因小鼠模型的构建,（,1,）构建,MYOC,基因,C1009,缺失突变过表达载体,（,2,）,DNA,显微注射,DNA,显微注射,1.,促排和取卵：人绒毛膜促性腺激素,(,hCG,),诱导母鼠排卵，和雄鼠合笼，用颈椎脱臼法处死有阴道栓的雌鼠，在解剖镜下找出输卵管伞部，解剖出受精卵。,2.,不育雄性公鼠：结扎公鼠,假孕雌性母鼠：在正式实验前，结扎公鼠需与性成熟的雌性小鼠交配，该雌性小鼠为假孕雌性母鼠。,3.,受精卵注射外源,DNA,：显微操作仪、显微持卵针和显微注射针。,4.,注射后的受精卵移植至受孕后,0.5,天的假孕母鼠的输卵管内,（二）验证转基因小鼠是否为原发性开角型青光眼模型,（,1,）测定,IOP,（,2,）小梁网细胞及视网膜神经节细胞的退行性改变,（三）功能研究,3.,定期测定,IOP,，分析,IOP,改变情况,4.,分析眼部各组织突变基因,mRNA,表达情况,包括：角膜、巩膜、视网膜、睫状肌、视神经、房水等。,5.,分析各组织突变,myocilin,蛋白表达分布情况,尤其是房水、小梁网细胞内突变蛋白聚集、排列信息,6.,分析细胞凋亡与视神经节细胞退行性改变的机制。,技 术 路 线 图,（四）近期任务,1,、将明确,C1009del,突变蛋白的功能、房水循环障碍的机制及其与视神经节细胞凋亡之间的关系，进而阐明,MYOC,突变对,POAG,发生的致病机理。,2,、早期诊断：制备基因芯片，用作症状前诊断或产前诊断，作为家族性青光眼的基因预警手段。,3,、个体化治疗：提供药物治疗的新靶点，作为个体化治疗的理论基础。,发表的论文及获奖情况,1,Xiaobing,Xie,Xin,Zhou,Xiying,Qu, Jing,Wen,Yanli,Tian, Fang,Zheng.Two,novel,myocilin,mutations in a Chinese family with primary open-angle glaucoma. Molecular Vision, 2008,14:1666-1672,2,谢小兵,，周新，田艳丽，曲喜英，匡多秀，朱惠斌，喻京生，宁兴旺。原发性开角型青光眼家系的,MYOC,基因突变研究。中华检验医学杂志，,2009,，,32,（,2,）：,157-161,3,谢小兵,，周新，田艳丽，曲喜英，匡多秀，朱惠斌。原发性开角型青光眼家系中一个新的,MYOC,基因突变。中国现代医学杂志，,2008,，,18,（,14,）：,2074-2077,4,匡多秀，李萍，周新，曲喜英，朱昕力，,谢小兵,(,通讯作者,),。,C1009del,突变质粒载体的构建及,MYOC,基因的有效干扰。国际检验医学杂志，,2011, 32,（,5,）,:529,5,匡多秀，李萍，,谢小兵,(,通讯作者,),。针对,MYOC,基因,RNAi,慢病毒载体的优化及筛选。实用预防医学杂志，,2011,18(10):1987-1990,“,原发性开角型青光眼家系的,MYOC,基因突变研究,”,项目获,2008,年度中华医学会第七次全国检验医学学术会优秀壁报奖；,本课题资助项目：湖南省自然科学基金、湖南省科技厅及教育厅科研资助基金。,谢谢！,