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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,血红蛋白,两个,肽链,两个,一肽链,四个亚铁,血,红素基团,血红蛋白的特点：,一、基础知识,凝胶色谱法（分配色谱法）,1,、凝胶：,一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）,2,、概念：,根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法,3,、原理：,用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质,A,路程较长，移动速度较慢,B,路程较长，移动速度较快,C,路程较短，移动速度较慢,D,路程较短，移动速度较快,D,相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个,B,缓冲溶液：,能够抵制（ ） 对溶液的（ ）的影响，维持,PH,基本不变。,外界的酸或碱,PH,值,.,概念：,带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,电泳：,.,电泳原理：,电泳利用了待分离样品中各种,分子带电性质的差异,以及,分子本身的大小,，,形状的不同,，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。,.,常见电泳类型：,琼脂糖凝胶电泳,聚丙稀酰胺凝胶电泳,SDS,聚丙稀酰胺凝胶电泳,迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小、形状。,电泳迁移率完全取决于分子的大小。,使用,SDS-,聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于,A,电荷的多少,B,分子的大小,C,肽链的多少,D,分子形状的差异,分离血红蛋白溶液,有机溶剂 （无色透明的甲苯层）,脂类物质 （,白色,脂溶性物质沉淀层）,血红蛋白溶液 （红色透明液体）,红细胞破碎物沉（暗红色沉淀物）,下列操作正确的是（ ）,A.,分离红细胞时采用低速长时间离心,B.,红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可,C.,分离血红蛋白溶液是低速短时间离心,D.,透析时要用,20mmol/l,的磷酸缓冲液，透析,12h,D,在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程中，分析无误的是,A,洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐,B,洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果,C,洗涤过程选用,0.1%,的生理盐水,D,透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质,D,2.,凝胶色谱操作,:,.,凝胶色谱柱的制作：,注意事项：,底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。,.,凝胶色谱柱的装填,凝胶的选择：,凝胶的前处理：,凝胶色谱柱的装填方法,：,洗涤平衡：,装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在,50cm,高的操作压下，用,300ml,的,20mmol/l,的磷酸缓冲液（,pH,为,7.0,）充分洗涤平衡,12,小时,。,50cm,高,装配好的凝胶柱,3,）样品加入与洗脱,加样前,打开下端出口，使柱内凝胶面上的（ ）缓慢下降到与（ ）平齐，关闭出口,缓冲液,凝胶面,加透析样品,开始进行层析,收集得到的纯化后的蛋白,调整缓冲液面：与凝胶面平齐,滴加透析样品：用（ ）将,1ml,（ ）的样品加到色谱柱的（ ）,样品渗入凝胶床：,（ ）,洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱,收集：,待,（ ）,接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每（ ）收集一试管连续收集,注意正确的加样操作：,不要触及破坏凝胶面,贴壁加样,使吸管管口沿管壁环绕移动,吸管,透析液,顶端,样品完全进凝胶层,5ml,红色的蛋白质,二、实验操作,蛋白质的提取和分离一般分为四步：,（,1,）,样品处理：,包括洗涤红细胞；血红蛋白释放；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。,（,2,）,粗分离：,透析除去分子较小的杂质。,（,3,）,纯化：,通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。,（,4,）,纯度鉴定：,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。,实践训练,1.,下列各项中，一般不影响在凝胶色谱法分离蛋白质中的分离度的是,( ),A.,层析柱高,B.,层析柱的直径,C.,缓冲溶液,D.,样品的分布,2.,蛋白质的提取和分离一般分为四步，即,、和,。后三步常用的方法依次是、。,B,粗分离,纯化,样品处理,纯度鉴定,透析法,凝胶色谱法,SDS,聚丙烯酰胺,凝胶电泳,3.,下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是（ ）,A,可采集猪血作为实验材料,B,用蒸馏水重复洗涤红细胞,C,血红蛋白释放后应低速短时间离心,D,洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液,A,
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