基因工程目的基因的获取课件

,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第五章 目的基因的获取,目的基因：,准备要分离、改造、扩增或表达的基因。,需要克隆的,DNA,片段,编码某种蛋白质,研究某基因结构和功能的关系,研究某基因与疾病的关系,目的基因的获取,化学合成法,基因组,DNA,文库,;cDNA,文库,聚合酶链式反应,直接从染色体,DNA,中分离,第一节,基因组,DNA,片段化,一、限制性内切酶法,用限制性内切酶把基因组,DNA,切成不同大小的片断。,酶切,由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。,1.,优点,2.,缺点,目的基因,内部,也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！,BamH I,BamH I,BamH I,gene,二、随机片断化,1.,限制性内切酶局部消化法,控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。, 内切酶识别位点的碱基数,影响所切出的产物的长度和随机程度。,（,1,）限制性内切酶的选用原则,1,）,4bp,的内切酶,平均每,4,6,（,4096,）,bp,一个切点。,2,）,6bp,的内切酶,平均每,4,4,（,256,）,bp,一个切点。,随机程度高。如,Hae,、,AluI,、,Sau3A,。, 内切酶粘性末端,能与常用克隆位点相连。,（,Sau3ABamH I,）,2.,机械切割法,（,1,）超声波,超声波强烈作用于,DNA,，可使其断裂成约,300bp,的随机片断。,（,2,）高速搅拌,1500,转,/,分下搅拌,30min,，可产生约,8kb,的随机片断。,（,3,）,DNA,溶液小孔喷射,注射器法可将,100kb,以上的,DNA,剪切成,10 kb,左右的片段。,1976,年,H.G. Khorana,提出了用化学方法合成基因的设想，并于,1979,年在,science,上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸,tRNA,基因的论文。,第二节 化学合成目的基因,要求：,1,、已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。,2,、,分子量较小的目的基因的制备,由已知氨基酸序列推测可能的,DNA,序列,* 化学合成法获取目的基因,一、目前常用的方法,磷酸二酯法、,亚磷酸三酯法、,固相合成法,自动化合成法。,磷酸三酯法、, 保护,dNTP,的,5,端,P,或,3,端,-OH, 用酸或碱的脱保护,（,1,）原理,1.,磷酸二酯法, 带保护的单核苷酸连接,保证合成反应的定向进行。,带,5,保护的单核苷酸与带,3,保护的另一个单核苷酸以,磷酸二酯键,连接起来。,（,2,）合成过程,下一个,5,端保护的单核苷酸又可以同,3,端保护的二核苷酸聚合。,原理是将所要合成的寡聚核苷酸链的,3-,末端先以,3-OH,与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠（,CPG,）连接，然后依次从,3-5,的方向将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，具体的合成和延伸过程如图。,2.,亚磷酸三酯法,化学合成的,DNA,片断一般在,200bp,以内。,二、 化学合成,DNA,片断的组装,用,T4,多核苷酸激酶,使各个片段的,5,端带上磷酸。,1.,互补连接法,预先设计合成的片断之间都有,互补区域,，不同片断之间的互补区域能形成有,断点,的完整双链。,（,2,）,5,端磷酸化,（,1,）互补配对,（合成的,DNA,单链的,5,端是,-OH,）,T4 DNA,连接酶,T4,多核苷酸激酶,使,5-OH,磷酸化,完整的,DNA,双链,（,3,）,连接酶连成完整双链,2.,互补延伸连接法,预先设计的片断之间有,局部互补区,，可以相互作为另一个片断延长的引物，用,DNA,聚合酶,延伸成完整的双链。,3,5,5,3,5,3,T4DNA,连接酶,Klenow,片段,引物,1.,直接合成基因,三、 寡聚核苷酸化学合成的优点,2.,合成引物（,20mer,左右）,（,1,）,mRNA,的含量很低，很难作,cDNA,3.,合成探针序列,4.,定点突变合成,合成带有,定点突变,的基因片断。,（,2,）有些基因比较短，化学合成费用较低,DNA,合成仪,5.,合成人工接头或衔接物,含有各种酶切位点,人工接头,（,Adaptor,）或,衔接物,（,Linker,）序列。,EcoRI,EcoRI,Linker,Adaptor,第三节,PCR,扩增获得目的基因,以前讲过关于,PCR,相关的知识，在这里不在,累述。,PCR,可以把,指定的基因片段,数,量放大,染色体,PCR,基因放大,连琐,反,应,聚合酶链反应,(polymerase chain reaction, PCR),第四节,从基因文库、,cDNA,文库获取目的基因,一、基因文库的构建,1.,基因文库（,gene library,）,将某种生物细胞的,整个基因组,DNA,切割,成大小合适的片断，并将,所有这些片断,都与,适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中,保,存和扩增,。理论上讲，这些重组载体上带有,了该生物体的,全部基因,，因此，称之为基因,组文库（,genomic library,）或基因文库（,gene,library,）。,组织或细胞染色体,DNA,基因片断,克隆载体,重组,DNA,分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组,DNA,文库,存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组,DNA,的集合,* 从基因组,DNA,文库获取目的基因,（,2,）,目前常用的载体,2.,构建基因文库的载体选用,载体能够容载的,DNA,片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的,重组子,的数目。,载体容量越大，所要求的,DNA,片断数目越少，所需的,重组子,越少。,（,1,）对载体的要求,载体系列： 容量为,24 kp,cosmid,载体： 容量为,50 kb,YAC,： 容量为,1 Mb,BAC:,容量为,300 kb,断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。,（,1,）染色体,DNA,大片段的制备,3.,基因文库构建的一般步骤,超声波（,300bp,）或机械搅拌（,8kb,）。, 物理切割法：,内切酶,Sau3A,进行局部消化。可得到,10-30kb,的随机片断。, 酶切法：,（,2,）载体与基因组,DNA,大片段的连接, 粘性末端直接连接,直接连接、人工接头或同聚物加尾。,人工接头法,（,adapter,）,同一限制酶切位点连接,不同限制酶切位点连接,平端连接,同聚物加尾连接,Bam,H,切割反应,GGATCC,CCTAGG,T4,DNA,连接酶,15,C,GATCC,G,G,CCTAG,+,目的基因用,Bam,H,切割,载体,DNA,用,Bam,H,切割,重组体,载体自连,目的基因自连,同一限制酶切位点连接,不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接,Eco,R,切割位点,Bg,l,切割位点,+,Eco,R+,Bg,l,双酶切,Eco,R+,Bg,l,双酶切,T4,DNA,连接酶,15,C,重组体,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,目的基因,载体,限制性内切酶,限制性内切酶,T4 DNA,连接酶,15,C,重组体,载体自连,目的基因,自连,5,3,3,5,载体,DNA,5,3,3,5,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,5,3,3,5,5,3,T(T),n,T,T(T),n,T,3,5,5,3,3,5,5,3, A(A),n,A,A(A),n,A,3,5,-,核酸外切酶,-,核酸外切酶,末端转移酶,+,dATP,末端转移酶,+,dTTP,T(T),n,T,A(A),n,A,A(A),n,A,T(T),n,T,T4,DNA,连接酶,15,C,重组体,人工接头及其应用,CCGAATTCG,GGCTTAAGC,5,-,3-,Eco,R,Eco,R,Eco,R,Eco,R,4.,基因组文库的大小,一个文库要包含,99%,的基因组,DNA,时所需要的克隆数目。,N=,ln (1-p),ln (1-f),p:,文库包含了整个基因组,DNA,的概率（,99%,）,f:,插入载体的,DNA,片断的平均长度占整个基因组,DNA,的,百分数,N,：所需的重组载体数（克隆数,）,例如：从人基因组,DNA,（总长度为,3109bp,）的文库中筛选到长约,1.5kb,目的基因的可能性为,99,，那么这个基因组文库要多大？,ln,（,1,0.99,）,N = = 9.210,6,ln,（,1,1.5103,3109,）,若用质粒（,pBR322,）克隆目的基因（,1.5kb,）需要有,910,6,克隆才能汇集人基因组全部,DNA,序列,;,若 用,噬菌体载体可,构建含,15kb,目的基因的人基因组,DNA,文库，按上式计算所,需要的重组体克隆数可以减少到,910,5,而要用柯斯质粒将,40kb,目的基因片断所需要重组体克隆数可降到,3.510,5,左右,均可满足建库要求。,三种常用基因组文库克隆载体的比较,载体种类,装载量,转 染 率,噬菌体,粘性质粒,(Cosmid),酵母人工染色体,(YAC),9,22kb,30,45kb,100,1000kb,10,5,10,6,转化子,gDNA,10,4,10,6,转化子,gDNA,500,转化子,gDNA,1.cDNA library,二、,cDNA,文库的构建,利用某种生物的,总,mRNA,合成,cDNA,，再将这些,cDNA,与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称,cDNA,文库。,2.cDNA,(complementary DNA,，互补,DNA),是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的,mRNA,经体外反转录后形成的互补,DNA,。,（,1,）,不含内含子序列,。,（,2,）可以在细菌中直接表达。,（,3,）包含了所有,编码蛋白质的基因,。,（,4,）比,DNA,文库小,的多，容易构建。,4.,构建,cDNA,文库的一般步骤,（,1,）总,RNA,（,total RNA,）提取,3. cDNA,文库的特点,提取总,RNA,有商业化的试剂盒（,kit,）。,分离,mRNA,用商业化的,Oligo dT,纤维柱。,利用,mRNA,都含有一段,polyA,尾巴，将,mRNA,从总,RNA,（,rRNA,、,tRNA,等）中分离纯化。,mRNA,只占总,RNA,的,1%-2%,。,（,2,）,mRNA,的分离纯化, 原理,mRNA,的分离纯化,Column,（柱）,反转录酶,mRNA,cDNA,3,5,5,AAAAAAA,TTTTTTT,Oligo dT,引物,（,3,）,cDNA,的合成,cDNA,第一链合成,oligo(dT),引导的,DNA,合成法：,利用真核,mRNA,分子所具有的,poly(A),尾巴的特性，加入,12-20,个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的,oligo(dT),短片段，由反转录酶合成,cDNA,的第一链。,随机引物引导的,cDNA,合成法,(randomly primed cDNA synthesis),：,根据许多可能的序列，合成出,6-10,个核苷酸长的寡核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链,cDNA,的引物。在应用这种混合引物的情况下，,cDNA,的合成可以从,mRNA,模板的许多位点同时发生，而不仅仅从,3-,末端的,oligo(dT),引物一处开始。,用,碱,处理,或用,RNaseH,降解,mRNA-DNA,杂交分子中的,mRNA,。,mRNA,cDNA,3,3,5,5,反转录酶,引物,mRNA,cDNA,第一链,3,3,5,5,引物,cDNA,第一链,3,5,引物, 降解,mRNA,模板,或,RNaseH,碱,cDNA,第二链合成,剩下的,cDNA,单链的,3,末端一般形成一个,弯回来的双链发卡结构,（机理不明），可成为合成第二条,cDNA,链的引物。用,DNA,聚合酶合成第二链,DNA,。,a.,自身引导合成法：,cDNA,第一链,5,cDNA,第二链合成,DNA,聚合酶,cDNA,第一链,cDNA,第二链,5,3,去掉发卡结构,核酸酶,S1,用,核酸酶,S1,可以切掉发卡结构（但这会导致,cDNA,中有用的序列被切掉！）。,cDNA,第一链,cDNA,第二链,5,3,cDNA,第一链,cDNA,第二链,5,3,5,3,b.,置换合成法：,原 理：,以第一链合成产物,cDNA,：,mRNA,杂交体作为切口平移的模板，,RNA,酶,H,在杂交体的,mRNA,链上造成切口和缺口，产生一系列,RNA,引物，在大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,的作用下合成,cDNA,的第二链。,获得的双链,cDNA 5,端也会有几对碱基缺失,优点：,a,）合成,cDNA,的效率高,b,）直接利用第一链的反应产物，不需纯化,c,）避免使用,S1,核酸酶来切割双链,cDNA,c.,引导合成法：,获得的双链,cDNA,能保留完整的,5,端序列,d.,引物,-,衔接头法,在双链,cDNA,末端接上,人工接头,，即可与载体连接，转入受体菌。,或借助,末端转移酶,给载体和双链,cDNA,的,3,端分别加上几个,C,或,G,，成为粘性末端。,(4),cDNA,与载体连接：,接上人工接头,粘性末端,CCC,CCC,末端转移酶,(5),双链,cDNA,克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖,5. cDNA,文库的大小,一个,cDNA,文库要包含,99%,的,mRNA,时所需要的克隆数目。,N=,ln (1-p),ln (1- ),p:,文库包含了完整,mRNA,的概率（,99%,）,:,某一种低丰度（不足,14,份拷贝）,mRNA,占细胞整个,mRNA,的比例,N,：所需的重组载体数（克隆数）,1,n,1,n,基因组,DNA,文库,cDNA,文库,三、基因组,DNA,文库与,cDNA,文库的比较,1,基因组,DNA,文库,的优点,相对于,cDNA,文库，基因组文库的优点：,cDNA,克隆只能反映着,mRNA,的分子结构，没有包括基因组的间隔序列，,cDNA,文库中，不同克隆的分布状态总是反映着,mRNA,的分布状态，即：高丰度,mRNA,的,cDNA,克隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度,mRNA,的,cDNA,克隆，所占比例较低，分离基因困难；,从,cDNA,克隆中，不能克隆到基因组,DNA,中的非转录区段序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能。,2,cDNA,文库的主要优点,cDNA,文库以,mRNA,为材料，特别适用于某些,RNA,病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。,cDNA,文库的筛选比较简单易行。,每一个,cDNA,文库都含有一种,mRNA,序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因。,cDNA,文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，直接应用于基因工程操作。,cDNA,克隆还可用于真核细胞,mRNA,的结构和功能研究。,3,cDNA,克隆的主要的缺点,cDNA,文库所包含的遗传信息要远远少于基因组,DNA,文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。,cDNA,文库虽能反映,mRNA,的分子结构和功能信息，但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构与功能方面信息。,在,cDNA,文库中，相应于高丰度,mRNA,的,cDNA,克隆所占的比例比较高，分离起来比较容易，而相应于低丰度,mRNA,的,cDNA,克隆所占的比例则比较低，因此分离也就比较困难。,四、基因文库的筛选与鉴定,重组体,(recombinant,，转化子,transformant),：,就是掺入或导入外源,DNA,后获得了新遗传,标志的细菌细胞或其他受体细胞。,1,、表型筛选法,（一）基因文库的筛选,(2),插入失活筛选法,(3),显色反应选择法,(-,互补法,),2,、,PCR,筛选法,(1),抗药性筛选,3,、菌落原位杂交法,4,、免疫筛选法,（二）基因文库的鉴定,1,、限制性核酸内切酶分析,2,、,Southern Blotting,3,、,DNA,序列测定法,