分子克隆载体课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分子克隆载体,基因工程的表达体系,操纵子理论在基因工程中的应用,目的基因翻译表达及其准确性,常用基因载体,基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源(目的) DNA而将目的DNA带入宿主细胞。,常用的载体有质粒、噬菌体、病毒,基因工程的表达体系,原核生物表达体系：,大肠杆菌,、,枯草杆菌、农杆菌,大肠杆菌表达体系的优点：,积累了充足经验，有数不清的载体可供应用；,可因不同载体而选择不同菌种作宿主；,操作安全，致病能力低 ；,成本相对低得多 ；,真核生物的基因先在原核体系上构建克隆，称为亚克隆（subclone），然后采用其它方式转移至真核细胞上表达。,缺点：,原核生物载体构建的重组体是无法进入动物细胞进行表达；,没有加工所需的酶系统；,热源、内毒素不易除去 ；,常会形成包涵体。,表达体系的发展,表达体 载体 宿主,第一代 原核生物表达体系 质粒、噬菌体 细菌,第二代 酵母表达体系 穿梭质粒 酵母,第三代 哺乳类细胞表达体系 病毒、脂质体 培养细胞,第四代 基因直接导入 DNA本身 生殖细胞、,体细胞、个体,基因工程的目的是使目的基因能,高效表达,。,基因表达受DNA结构、蛋白质因子与核酸相互辨认、结合等组成的表达体系的调控。,基因表达调控,可在转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰等水平进行,基因工程载体的构建必需应用表达调控的基本理论知识，应用已知的调控序列进行重组、改造,。,操纵子理论在基因工程的应用,一、启动子与转录调控,原核生物的转录单位是,操纵子,，操纵子包括相关结构基因及其上游的调控序列。,结构基因,调控序列,操纵子,P：启动序列 O：操纵序列 I：调节序列,I,P,O,CAP,调控区,Z Y X,结构基因,以乳糖操纵子（lac operon）,为例：,诱导物,Z Y X,I,P,O,CAP,Z Y X,I,P,O,CAP,二、强启动子的构建,Z Y X,侵犯细菌时，只是DNA侵入，然后利用细菌的酶来复制、转录、翻译。,3 A CACUAGG5 16sRNA,含有串联的来自噬菌体的强启动PL及PR，启动子的串联可能有相互增强作用。,含有CIts857组件，此组件可变温诱导目的基因的表达。,Z Y X,四、转录终止结构的插入,噬菌体侵入菌体后，把自身DNA加进细菌DNA里（整合），作为细菌基因的一部分，随菌的细胞分裂而增殖，这种生活状态称为溶原（lysogen）。,可因不同载体而选择不同菌种作宿主；,原核生物载体构建的重组体是无法进入动物细胞进行表达；,真核生物启动子保守序列,核糖体结合位点（S-D序列）,它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。,Ptac17 TTGACA TATAAT,基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源(目的) DNA而将目的DNA带入宿主细胞。,一种以pBR322为基础的酵母质粒，两个抗药基因及左下方的半圆来自pBR322，右上半圆来自酵母，包括启动子、糖代谢酶类及氯霉素抗性基因，可在大肠杆菌体系重组再转化酵母细胞 称为穿梭质粒（shuttle plasmid）,使RNA聚合酶变构，转录停顿；,5ATG NAT GNA TGZ 123 456,保证正确阅读AUG的序列ATGNATGNATG，,（LacZ基因 N端序列）,开始转录,T T G A C A,A A C T G T,-35 区,(Pribnow box),T A T A A T Pu A T A T T A Py,-10 区,1,-30,-50,10,-10,-40,-20,5,3,3,5,原核生物启动子保守序列,RNA-pol辨认位点,(recognition site),5,5,RNA聚合酶保护区,结构基因,3,3,RNA转录起始,-35区,-10区,TTGACA,TTAACT,TTTACA,TATGAT,TTTACA,TATGTT,TTGATA,TATAAT,CTGACG,TACTGT,N,17,N,16,N,17,N,16,N,16,N,7,N,7,N,6,N,7,N,6,A,A,A,A,A,trp,tRNA,Tyr,lac,rec,A,Ara,BAD,TTGACA,TATAAT,共有序列,TATA,盒,CAAT,盒,GC,盒,增强子,顺式作用元件,结构基因,-GCGC-CAAT-TATA,转录起始,真核生物启动子保守序列,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,P,tac,启动子,P,trp,与,P,lac,的杂化产物,P,tac,比原来各自的活性强,-35区 -10区,P,trp,TTGACA TTAACT,共有序列,TTGACA TATAAT,P,tac17,TTGACA TATAAT,乳糖操纵子的天然诱导物是,乳糖,乳糖类似物异丙基-D -硫代半乳糖苷（,IPTG,） 有更强的诱导作用,。,IPTG配合使用在基因工程可作蓝白斑筛选。,LacZ基因编码的乳糖苷酶,X-gal,蓝色吲哚产物,三、蓝白斑试验（IPTG-Xgal 试验,）,诱导物,Z Y X,P,O,Z Y X,P,O,乳糖,标志补救（-半乳糖苷酶法）,lacZ,Am,N,2,H,片段,COOH,片段,lacZ,X-gal,Lac Z,蓝色化合物,X-gal,（LacZ基因 N端序列）,插入片段,（LacZ基因失活）,LacZ基因 N端序列,LacZ酶,转录终止：非依赖因子的转录终止需要,茎环结构,，以t（termination）代表。,C G G C C G C G G C,C,U,A,A,U,G,A,5AUACCA UUUUUUUUU3,四、转录终止结构的插入,茎环结构使转录终止的机理,使,RNA,聚合酶变构，转录停顿；,使转录复合物趋于解离，,RNA,产物释放。,5pppG,5,3,3,5,RNA-pol,把启动子连同其附属成分，置换了pBR322的tetr基因，成为以启动子为组件的质粒。,T A T A A T Pu A T A T T A Py,Z Y X,第一代 原核生物表达体系 质粒、噬菌体 细菌,Ptrp与 Plac的杂化产物 Ptac比原来各自的活性强,C G G C C G C G G C,I V,含有串联的来自噬菌体的强启动PL及PR，启动子的串联可能有相互增强作用。,第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。,如巨细胞病毒（CMV）启动子，猿猴病毒SV40的组件等。,如携带杀虫基因的病毒对农作物进行生物防治。,如果插入序列自身不含ATG起始密码,或限制酶切点不能把读码框准确置于ATG之后,或插入片段编码未清楚,可在目的基因之前设保险序列:,原核生物载体构建的重组体是无法进入动物细胞进行表达；,基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源(目的) DNA而将目的DNA带入宿主细胞。,目的基因翻译表达及其准确性,基因工程载体的构建必需应用表达调控的基本理论知识，应用已知的调控序列进行重组、改造。,噬菌体的生活周期：,如巨细胞病毒（CMV）启动子，猿猴病毒SV40的组件等。,侵犯细菌时，只是DNA侵入，然后利用细菌的酶来复制、转录、翻译。,分离得到某些噬菌体，在低温时（30）建立溶原，用高温（420C）则出现裂解。,如在Galk基因前插入目的基因，与无插入的空载pKO比较，并无放射活性的增强，则说明插入片段不存在有启动子。,五、增强子,转录起始前-30区为TATA盒，还有多种顺式作用组件相互配搭成启动子。,增强子,远距离地、不同方向地控制启动子的活性。增强子的核心序列是TGTGGAATTAG。,增强子的作用特点有：,非特异性远距离操纵、多方向性。,酵母结构基因的上游还有上游活化序列（upstream activation sequence，UAS）。,目的基因翻译表达及其准确性,核糖体结合位点（S-D序列）,mRNA有与核糖体DNA结合的位点S-D 序列(Shine-Dalgarno)，又称为核糖体结合点。,3 A CACUAGG5 16sRNA,U C,U-C-C-U,5A G G A PuPuUUUPuPuAUG mRNA,AGGA后的的7个Pu是核糖体小亚基的辨认部位,lF1、3,met-GTP-lF2,30S,50S,GDP+Pi,lF2,fmet,fmet,30S,50S,lF1、3,mRNA,GTP,基因克隆时的定向插入,插入序列两边的酶切口不同,插入的组件不会倒装，保证了在其下游目的基因插入后，沿53方向正确转录，这种构建方式称为定向插入,。,EcoRI,HindIII,Ori复制起点,LacZ,AP,R,pUC19,如果插入序列自身不含ATG起始密码,或限制酶切点不能把读码框准确置于ATG之后,或插入片段编码未清楚,可在目的基因之前设保险序列:,5ATGNATGNATG,5ATGNATGN ATG 123 456,5ATGN ATG NAT GXY 123 456,5ATG NAT GNA TGZ 123 456,能正确读出三联体密码的起始序列,TAA,ATG,I II III IV V,I V,I II V,ATG,I II III V,I,II,III,Ori,转录起始 翻译起始 信号肽 成熟蛋白质 转录终止区,CS,CS,CS,CS-cloning site,常规质粒载体,质粒(plasmid,),Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。,Plasmid chromosome,第二代 酵母表达体系 穿梭质粒 酵母,在A蛋白（有终止复制功能），E蛋白（是包装蛋白），D蛋白（是插入蛋白）共同作用下使重组体DNA转入头部。,Gal + ATP Gal-1-P+ADP,6、质粒的不亲和性：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。,如巨细胞病毒（CMV）启动子，猿猴病毒SV40的组件等。,第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。,原核生物的转录单位是操纵子，操纵子包括相关结构基因及其上游的调控序列。,噬菌体可以容纳较大的目的基因。,（1）有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有1个；,可因不同载体而选择不同菌种作宿主；,pBV221分子量小，易转化，,操纵子理论在基因工程中的应用,如巨细胞病毒（CMV）启动子，猿猴病毒SV40的组件等。,Z Y X,RNA-pol辨认位点,AGGA后的的7个Pu是核糖体小亚基的辨认部位,原核生物启动子保守序列,基因载体应具备的条件：,（1）有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有1个；,（2）有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；,（3）有一定容量；,（4）有相当的抄本数，即每个宿主菌可能容纳的最多数。,多克隆位点,ori,复制起始点,遗传标记,Amp,polylinker,基因载体,1、质粒是细菌染色体外能,自主复制,的环形双链DNA分子。,2、编码,抗菌素抗性基因,的质粒叫,R质粒,。,3、质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态，但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体地复制而复制。,4、质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的,穿梭质粒,，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。,质粒的生物学特性,5、根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为,严紧型复制质粒,（拷贝数少，为1-5个）与,松弛型复制质粒,（拷贝数多，可达10-200个拷贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。,6、质粒的,不亲和性,：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。,第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322。,第二阶段：,增大载体容量,（降低载体长度），建立,多克隆位点区,和新的,遗传标记,基因。如pUC系列载体。,第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。,发展概况,pBR322为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚。是最早应用于基因工程的载体之一。把pBR322用限制性内切酶切去某片段，换上合用的,表达组件,，就可以构建成工作所需的新载体。,许多实用的质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成。可见其原型质粒在使用上有优点。,pBR322,有过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有,单一切口的位点也多达数十个，,几乎具备了所有常用限制酶都能切开并插入目的基因的优越条件。,此外，pBR322DNA，被限制性内切酶消化后产生的片段大小均已知道，可以作为核酸电泳的,分子质量标准,。,普通型载体pBR322的结构图,抗药性标志的选择,pBR322,Amp,Tet,插入片段,Amp平板,Tet平板,pUC质粒系列,pUC质粒系列也是在pBR322基础上改建成的。,它含有pBR322的大部分，包括完整的amp,r,基因和复制起始点。去除了pBR322的tet,r,区段，换用了M13噬菌体的476bp片段，含,LacZ不得,基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接头polylinker.,476bp片段含有E.coli的lacZ基因的 5-序列，表达半乳糖苷酶的片段。,LacZ的上游包括乳糖操纵子上的启动子Plac和操纵基因O。,lacZ之内是M13的多功能连接器。,三个显著特点：,（1）,分子量更小,，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有,更高的拷贝数,（每个细胞含500-700个拷贝）。,（2）含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因,LacZ，,可利用,-互补原理进行,蓝白筛选。,（3）,多克隆位点区（MCS）,由人工合成的多个单一酶切位点构成。,其MCS区与M13mp噬菌体载体的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接转移到M13mp载体，进行,DNA测序,和,体外突变,等研究。,pKO系列,组成：以,半乳糖激酶（,Galk,）,基因取代pBR322的,Eco,RI-,Pvu,II位点包括,ter,r，.,表达产物催化,Gal + ATP Gal-1-P+ADP,以,14,C标记的半乳糖作底物,检测生成的*Gal-1-P的放射性。,在Galk基因上游插入目的基因，根据基因表达产物半乳糖激酶活性，即,14,C-Gal-l-P的放射性，可,定量估算启动子功能的强弱,。,如在Galk基因前插入目的基因，与无插入的空载pKO比较，并无放射活性的增强，则说明插入片段不存在有启动子。,噬菌体载体,噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是细菌里的“寄生虫”。它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。,侵犯细菌时，只是DNA侵入，然后利用细菌的酶来复制、转录、翻译。,入侵E.coli后，可以按裂解或建立溶原两种生活方式生存和繁殖（图1-5）。,图左示噬菌体在宿主内进行独立复制，在1个菌体内生长出100个左右的新噬菌体，并冲破（杀死）细菌释放出来，再度感染其它活菌，称为裂解。,噬菌体侵入菌体后，把自身DNA加进细菌DNA里（整合），作为细菌基因的一部分，随菌的细胞分裂而增殖，这种生活状态称为溶原（lysogen）。,噬菌体的生活周期：,裂解侵入细菌-独立复制-裂解（冲破细胞膜）-再感染其他细菌。,噬菌体的结构和用途,噬菌体线性双链DNA病毒，具有末端互补的12nt，感染细菌后粘端互补成双链环状。全长48 531bp，含50多个基因。,噬菌体基因大致分为4个区：,结构区A J19个基因，,编码头、 尾部蛋白质为,结构区,重组区,att,（attachment）、,int,（intagrate）及,xis,（excission），,调控区,启动子、终止子和N、CI基因， O-R 为,裂解区,.,噬菌体及其组件的应用,噬菌体可以,容纳较大的目的基因,。例如用置换法可去掉长达20kb的DNA，换入相应长度的目的基因。,基因文库构建,常使用载体；,不少先进的质粒应用,组件,进行构建。,噬菌体从溶原转为裂解是一种,可诱导过程,。,诱导的因素可能很多，实验室常用的是热诱导:,分离得到某些噬菌体，在低温时（30）建立溶原，用高温（42,0,C）则出现裂解。这些噬菌体的cl基因是温度敏感突变型的，称为c1,ts,。,cl,ts1857,，可作为组件插入质粒DNA内。目的基因插在cl,ts857,下游，重组体的目的基因在42表达，30不表达。这种方法称为,热诱导表达,，使用的是,温敏开关。,CI,ts857,ori,目的基因,P,L,阻遏蛋白,30下培养：,目的基因,阻遏蛋白,42下培养：,失活,P,L,和 P,R,P,L,和,P,R,是噬菌体上2个主要的启动子，都是启动能力相当强的转录构件。把启动子连同其附属成分，置换了pBR322的tet,r,基因，成为以启动子为组件的质粒。,（,1）粘粒（cosmid）,能容纳,大片段,（45kb）的小分子（4kb 6kb）载体。,组成：质粒复制原点，抗药基因，多克隆位点，已连接入的cos位点。,构建基因文库的载体,（2）DNA的体外包装,是提高噬菌体,转染效率,的有效方法,在,A蛋白,（有终止复制功能），,E蛋白,（是包装蛋白），,D蛋白,（是插入蛋白）共同作用下使重组体DNA转入头部。,高效表达质粒,组成特点:,强启动子,保证正确阅读AUG的序列ATGNATGNATG，,rrnB抗终止序列，,多位点接头。,pBV系列质粒,pBV221分子量小，易转化，,含有,串联,的来自噬菌体的,强启动P,L,及P,R,，启动子的串联可能有相互增强作用。,含有,CI,ts857,组件,，此组件可,变温诱导,目的基因的表达。这一组件的存在，还可适当地抑制宿主菌的蛋白酶活性，达到提高表达量的目的。,带有真核生物基因表达组件的质粒,真核生物与原核生物催化转录、翻译及其后修饰的酶和起始复合物的结构不同，医学研究需要能表达真核生物基因的表达载体。,由于病毒对宿主细胞有依赖性和可整合性，真核表达组件不少来自,病毒,。如巨细胞病毒（CMV）启动子，猿猴病毒SV40的组件等。,酵母质粒和大容量载体,酵母是单细胞真核生物，可接受质粒转化。,酵母质粒有Yip（integrate）整合型，,Yep（epi-some）附加体型，,Yrp（replication）复制型。,pYEJ001,一种以pBR322为基础的酵母质粒，两个抗药基因及左下方的半圆来自pBR322，右上半圆来自酵母，包括启动子、糖代谢酶类及氯霉素抗性基因，可在大肠杆菌体系重组再转化酵母细胞 称为,穿梭质粒（shuttle plasmid）,昆虫杆状病毒,（baculovirus）,如核型多角体病毒ACNPV ，昆虫体系的优点是,表达效率高,，目的基因插入的,容量相对大,，使用安全等 。,目前在农业基因工程上应用较多。如携带杀虫基因的病毒对农作物进行生物防治。,YAC酵母人工染色体,把酵母染色体与基因复制和表达有关的主要组件都组装在质粒上，令质粒行使酵母的转录功能和复制功能。,pYAC只以单抄本方式繁殖，所以不适用于以生产为目的的基因工程。 主要用于,人类基因组研究,和,巨大基因,如DMD基因达Mbp（10,6,bp）数量级基因的克隆。,