RTPCR检测外源基因

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,PCR检测外源基因的整合 RT-PCR检测外源基因的表达,1,PCR检测外源基因的整合,（1）PCR的基本原理,（2）检测外源基因的整合,（3）PCR检测的优缺点,2,PCR的基本原理,聚合酶链式反应简称PCR（英文全称：Polymerase Chain Reaction）,其基本原理是：DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。,实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制 。,3,4,检测外源基因的整合,在转基因个体的检测中，通过设计外源基因两端的特异引物，采用PCR技术就可以使外源基因片段得以大量的扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测特异性扩增带的有无，从而判断外源基因是否整合到受体植物的基因组中。,5,PCR检测的优缺点,优点：,十分灵敏，可以适用于微量的DNA样品的检测；对模板DNA的质量要求不高；,检测结果基本准确；,操作简单 ；,适合转基因体的早期检测。,缺点：,对引物设计的要求较高；,很容易受到外界因素的干扰，出现假阳性扩增；,检测结果不够精确；,即使检测到外源基因，载体携带外源基因进入受体细胞可能以游离的方式存在于基因组外，未能整合到染色体上。,6,PCR检测所用仪器,7,PCR 仪,8,垂直电泳装置,9,RT-PCR检测外源基因的表达,（1）RT-PCR的基本原理,（2）RT-PCR技术的相关试剂,10,RT-PCR的基本原理,RT-PCR又名逆转录聚合酶链反应（reverse transcription PCR ）,原理是：提取组织或细胞中的RNA，或以转基因个体总RNA或mRNA作为模板链，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cRNA。一方面，以cRNA为模板链进行PCR扩增，而获得目的基因。另一方面，以能否获得特异性的cDNA扩增条带实现基因表达的检测。,11,12,13,14,RT-PCR技术相关试剂,oligo: 多聚体，相当于mRNA引物,AMV（M-MLV）：逆转录酶,dNTP：脱氧核苷酸,RNase：RNA酶抑制剂,PCR Buffer：RT-PCR缓冲液,MgCl2：2价镁离子,15,RT-PCR检测的优劣势,此方法简单、快捷、对mRNA抽提的数量和质量要求都不高。,但是和PCR技术一样，RT-PCR也存在假阳性的问题，所以外援基因的转录的最后确定，还需要用Northern杂交的结果进行验证。,16,谢谢！,17,