第四章 核酸化学

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五节,核酸酶,第四章 核酸化学,第一节,核酸的化学组成,第二节,DNA,的空间结构与功能,第四节,核酸的理化性质及其应用,第三节,RNA,的空间结构与功能,第一节 核酸的化学组成,脱氧核糖核酸(,deoxyribonucliec,acid,DNA),一. 核酸的种类,二.核酸的化学组成,碱基,(,base),戊糖(,pentose,),核糖核酸（,ribonucliec,acid, RNA),核酸,核苷酸,核酸酶,磷酸(,phosphate),核 酸 的 种 类,脱氧核糖核酸,(,DNA),核糖核酸（,RNA),两类核酸的基本化学组成比较,DNA,RNA,嘌呤碱,腺嘌呤 (,A ),腺嘌呤 (,A),（,Purine,bases,）,鸟嘌呤 (,G),鸟嘌呤 (,G),碱基,(,Base),嘧啶碱,胞嘧啶 (,C),胞嘧啶(,C),（,Pyrimidine,bases,）,胸腺嘧啶,(,T),尿嘧啶,(,U),戊糖,D-2-,脱氧核糖,D-,核糖,(,Pentose,),酸,磷酸,磷酸,(,Acid),C,N,C,C,C,N,N,N,C,H,H,H,NH,2,嘌呤碱,1,2,3,4,5,6,7,8,9,嘌 呤,C,N,C,HC,C,C,N,N,H,CH,NH,2,C,N,C,C,C,C,N,N,H,CH,O,H,2,N,腺嘌呤,鸟嘌呤,6,2,6,H,C,HN,HC,CH,CH,N,NH,2,O,C,C,HN,CH,CH,N,H,O,O,N,C,HN,CH,C,CH,H,O,O,C,HN,C,C,CH,N,H,CH,3,嘧 啶,胞嘧啶（,C）,尿嘧啶（,U）,胸腺嘧啶（,T）,1,2,3,4,5,6,核糖核酸（,RNA）,脱氧核糖核酸（,DNA）,核酸,核苷酸,核苷,磷酸,戊糖,碱基,核 酸 的 组 成,核酸酶水解,由戊糖和碱基以糖苷键连接而成,核 苷,脱氧核糖,核糖,嘌呤碱基,嘧啶碱基,C,N,C,HC,C,C,N,N,H,CH,NH,2,+,C,N,C,HC,C,C,N,N,H,CH,NH,2,腺苷,9,C,N,C,HC,C,C,N,N,H,CH,NH,2,+,C,N,C,HC,C,C,N,N,H,CH,NH,2,脱氧腺苷,9,1,由核苷的戊糖羟基被磷酸酯化而成,5,核苷酸的命名,含一个磷酸基团：核苷一磷酸（,NMP,）,含两个磷酸基团：核苷二磷酸（,NDP,）,含三个磷酸基团：核苷三磷酸（,NTP,）,N,代表各种碱基的名称,环化核苷酸：,cNMP,O,第二节,DNA,的结构与功能,一、,DNA,的结构,二、,DNA,的生物学功能,1.,DNA,的一级结构,2.,DNA,的二级结构,3.,DNA,的三级结构,携带并传递遗传信息,四种脱氧核糖核苷酸通过3、5 -磷酸二酯键彼此连接而形成的直线形或环线形分子。,DNA,分子中核苷酸的排列顺序。,DNA 的 一 级 结 构,核苷酸链的书写方法,双螺旋结构,即,DNA,分子的空间结构,1.,Chargaff,碱基组成规律,2.,DNA,晶体的,X-,射线图谱研究,各原子之间的键长、键角,一、,DNA,分子模型建立,DNA 的 二 级 结 构,由,James Watson,和,Francis Crick,提出,(1) 腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔数相等,A=T,鸟嘌呤与胞嘧啶的摩尔数相等,G=C,嘌呤总数=嘧啶总数,A+G=C+T,(2),DNA,的组成具有种的特异性,(3),DNA,的碱基组成没有组织的特异性,且较为稳定,不随年龄、营养状态、,环境改变的影响,Chargaff,碱基组成规律,分子双螺旋结构模型要点,1. 由两条反向平行的脱氧多核苷酸（两条链的走向为5,3,和3,5,），围绕一中心轴（假想轴）构成右手双螺旋结构。,彼此间以磷酸二酯键相连，构成的骨架。,2. 碱基在双螺旋内侧。,双链中相对的碱基按和通过氢键配对连接，形成互补。,磷酸基与脱氧核糖在外侧，,3,5,C,3,5,C,糖环平面与中心,轴平行。,3. 碱基平面与中心,轴垂直，各相邻,平面部分重叠。,3.4,nm,4.双螺旋的直径为,2,nm,沿轴向，每个碱基平面,的距离为,0.34,nm,每圈螺旋含有,10,对,核苷酸，其轴向距,为,3.4,nm,(3) 离子键,5.维持,DNA,双螺旋稳定的作用力,(1),互补碱基间的氢键,(2) 使碱基平面堆积的平面间范德华力,又称碱基堆积力,二、,DNA,结构的多样性,A-DNA：,右手螺旋,B-DNA：Watson-Crick,模型，右手螺旋生理条件下,DNA,最稳定,的结构形式,Z-DNA：,左手,螺旋,DNA,的 三 级 结 构,原核生物,真核生物,没有典型的细胞核结构，,真核生物的三级结构是由分子与组蛋白(,histine,),和非组蛋白(,nonhistine,protein,NHP),结合组成。,被认为是原核生物的三级结构,被认为是真核生物的三级结构,超螺旋结构,核小体结构,DNA,超 螺 旋,结 构,H,2,A、H2B、H3,和,H4,各两分子,组成组蛋白八聚体，构成,核心组蛋白,双螺旋,DNA,以左手超螺旋的方式绕核心颗粒1.75圈，缠绕在,核心组蛋白,表面，构成,核心颗粒,核心颗粒,和,连接区,DNA,及附着在连接区,DNA,上的,组蛋白,H1,构成,核小体,一个个核小体连接成串珠状结构,染色单体,折叠,折叠,第三节,RNA,的空间结构和功能,一、,RNA,的类型,1. 核糖体,RNA(ribosomal RNA,rRNA,),3. 转运,RNA (transfer RNA,tRNA,),2. 信使,RNA (messenger RNA,mRNA,),4.核内不均一,RNA(,HnRNA,),二、,RNA,的结构与功能,5.小核,RNA(,SnRNA,),mRNA,的结构与功能,一 、,mRNA,的结构特点,(1) 3末端有多聚腺嘌呤的结构(,polyA,),(2) 5末端具有帽子结构(,m,7,GpppN,m,),(3) 一种,mRNA,只含有一条多肽链的信息,由,HnRNA,经过剪接而成,半衰期最短，几分钟到数小时,二 、,mRNA,的功能,蛋白质合成的直接模板,把核内,DNA,的碱基顺序（遗传信息），按照碱基互补的原则，抄袭并转送至胞质，在蛋白质合成中用以翻译成蛋白质中氨基酸的排列顺序,。,tRNA,的结构与功能,1. 分子量最小一类,RNA,占,RNA,总量10-25%,2. 分子中含有10%-20%的稀有碱基,一、,tRNA,的结构特点,如假尿嘧啶（,）,二氢尿嘧啶（,DHU）,甲基化碱基（,m,G,m,A,),等,3. 3末端有,CCA-OH,是携带氨基酸的部位,4. 具有识别密码子功能的反密码子,5. 二级结构为三叶草形, 有三个环状结构（,DHU,环、,T,环、反密码环,）,三级结构为“倒,L”,形,二、,tRNA,的功能,在蛋白质的合成过程中作为各种氨基酸的载体并将其转呈给,mRNA,tRNA,的三级结构,rRNA,的结构与功能,一、,rRNA,的结构特点,1. 含量最丰富,约占总,RNA,的80%以上,2. 与核糖体蛋白结合成核蛋白体,rRNA,与蛋白质既可分离,又可结合,3. 核糖体由大小两个亚基构成,两亚基呈不 规则形状,聚合时中间有裂缝,可通过,mRNA,。,二、,rRNA,的功能,是细胞内蛋白质合成的场所,其他小分子,RNA,小核,RNA（,SnRNA,)、,小核仁,RNA(,SnoRNA,)、,小胞质,RNA（,scRNA,/7SL-RNA),功能：参与,HnRNA,和,rRNA,的转运和加工,原核生物核糖体的亚基组成,原核生物核糖体,真核生物核蛋白体,核 酶,某些,RNA,分子本身具有自我催化能力，可以完成,rRNA,的剪接。这些,RNA,称为核酶（,ribozyme,),意义：扩充了酶的范围，使之不再局限于蛋白质。,第四节 核酸的理化性质及其应用,一、 核酸的粘度,二、核酸的紫外吸收特性,三、核酸的变性、复性及其分子杂交,一 、 核 酸 的 粘 度,* 分子量越大粘度也越大,分子比分子小，粘度也就小,* 生物分子的空间结构也影响粘度,。,线形分子,无规线团分子,球形分子,二、核酸的紫外吸收特性,嘌呤碱和嘧啶碱有共轭双键，都能强烈吸收紫外光，最大吸收波长为,260,nm,蛋白质对紫外光的最大吸收波长是,280,nm,紫外分光光度法检测核酸的纯度,通过测定波长在260,nm,和280,nm,处吸光度的,比值(,A,260,A,280,),来估计核酸样品的纯度,DNA,溶液：,A,260,A,280,=1.8,RNA,溶液：,A,260,A,280,= 2.0,方法,：,在波长260,nm,紫外线下，吸光度为1.00时，,紫外分光光度法估计核酸的浓度,取5,l,双链,DNA,样品,加水稀释至1,ml。,以1,ml,纯水作为参照测定波长在260,nm,处的吸光度值(,260,),假如测得稀释样品的,260,值为0.500，,相当于50,g/ml,的双链,DNA,40,g/ml,的单链,DNA,或,RNA,20,g/ml,的单链寡核苷酸,问题1,那么原液中,DNA,的浓度是,？,g/ml,三、核酸的变性、复性及其分子杂交,(一) 变性,(二) 复性,(三),分子杂交,(一),核 酸 的 变 性,1. 概念,核酸分子的双螺旋结构解开，氢键断裂（不涉及共价键的断裂），使双链分离，这种现象称为核酸的变性,2.,引起核酸变性的因素,如乙醇、丙酮、尿素、酰胺等,加热、,介质中的,pH,过酸或过碱、,有机溶剂、,3.,核酸的变性与降解的区别,降解,其过程是不可逆的。,是指多核苷酸链中的磷酸二酯键断裂，,使分子量降低，,不发生分子量的变化。,一般是可逆的，,变性,4.,蛋白质和,核酸的变性,两者均不涉及共价键的断裂,一级结构不破坏,粘度下降，生物活性丧失,分子的热变性,双螺旋结构即遭破坏，氢键断裂，双链分离。,将的稀盐溶液加热至8095(或以上)数分钟,，,d.,丧失生物活性,a. 260nm,处的紫外吸收值升高,b.,粘度下降,c.,浮力、密度升高,（,增色效应,）,变 性,DNA,的 特 点,DNA,解链曲线,拐点所对应的温度，,代表变性,50,时温度，称为解链温度，通常称为融解温度。,用符号,Tm,表示,70,85,之间,“,”,形曲线,Tm,值的大小主要与下列因素有关,中对的含量,碱基对的比例越高，,Tm,值越高,pH,和离子强度不变,根据百分含量，,则可计算样品的,Tm,值,Tm69.3 + 0.41*(,),（G+C）%（Tm-69.3）,*2.44,介质中的离子强度,离子强度低,Tm,值低,变性温度范围较宽,离子强度大,Tm,值高,变性温度范围较窄,的变性,双链的,RNA,分子,RNA-DNA,杂化分子,可变 性,中性,pH,条件下，三者,Tm,值大小为：,双链,RNA,分子,RNA-DNA,杂交分子,DNA,分子,(二) 核酸的复性,DNA,热变性后的复性,常常称为,退火,。,变性的,DNA,或,RNA,在去除变性因素,并处于适当的条件下，,又可重新结合成为双螺旋结构,这一过程称为复性。,1.概念,彼此分离的双链,2. 复性过程,两种情况,（1）两条完全分开的单链通过随机碰撞形,成互补短片段的双螺旋,。,（2）尚未配对的碱基很快地 “对齐”。迅速,形成双链直至双螺旋结构。,复性后分子性质,一系列的理化性质随即恢复,d.,生物活性部分恢复,a. 260nm,处的紫外吸收值下降,b.,粘度上升,c.,浮力、密度降低,（减色效应）,(三) 核酸分子杂交,在一定条件下（适宜的温度、,pH,及离子强度），可按碱基互补原则复性形成双链，此过程称为核酸分子杂交。,1.概念,具有一定同源性的两条核酸单链，,变性,复性,不完全同源核酸单链分子杂交,突环,2.可发生杂交的核酸分子,(1)两条同源的,DNA,链,(2)两条同源的,RNA,链,(3)一条,DNA,链一条,RNA,链,3.核酸杂交的应用,（1）测定核酸分子碱基组成,（2）检测某些因基因突变引起的疾病,第五节 核 酸 酶,指所有可以水解核酸的酶。,一、分类,1. 按照作用底物的不同分,DNA,酶（,DNase,):,水解,DNA,RNA,酶（,RNase,):,水解,RNA,2. 按照作用的部位分,核酸外切酶：,作用于,5,或,3,末端,核酸内切酶：,作用于链的内部,二、,限制性,核酸内切酶,作用于链的内部，,具有,严格序列依赖性。,切,基因工程的,手术刀,没有,限制性内切核酸酶,的发现和应用，就很难有今天分子生物学与基因工程的快速发展。,功能：,根据需要在特定的位点精确切割,双链,DNA,分子,基因工程中,最常用,的,工具酶,之一,