植物组织培养课件 第二章 实验室设备和基本操作技术

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第二章 实验室设备和根本操作技术,第二章 实验室设备和根本操作技术,内容提纲,一、实验室布局,二、根本仪器设备,三、培养基及其配制,四、灭菌技术,五、外植体,六、培养条件,七、继代培养,八、试管苗驯化一再,一、植物组织培养实验室布局,开展植物组织培养工作，应配备：,一、植物组织培养实验室布局,1.植物组织培养室的根本设置分室,1准备室：进行接种前材料准备用。,进行的内容有：,A.洗涤室：器皿和植物材料清洗。,B.药品室：存放各类药品。,C.称量室：称量用,D.培养基配制室：,E.灭菌室 ：培养基、器皿灭菌用,一、植物组织培养实验室布局,1.植物组织培养室的根本设置分室,开展植物组织培养工作，应配备：,2无菌操作室接种室,3培养室：是植物材料培养的场所，存,放接好种的培养瓶用,4驯化室：转瓶前进行驯化用。,5其他设施：,A.细胞学实验室：显微镜检查用。,B.温室、大棚：,C.物品贮藏室：,D.生化分析实验室：,一、植物组织培养实验室布局,2.植物组织培养室的具体规划,根据规模需要， 一般在40以上。,规划原那么：要科学、合理、实用，方便操作。,减少污染机率。,准备室,44,84 ,准备室,接种室,缓冲间,培养室,生命科学院组织培养室平面图,12,24,12,24,二、实验室需要根本仪器设备,1.,灭菌设备,A.,高压蒸汽灭菌器,立式高压灭菌器,卧式高压灭菌器,手提式高压灭菌器,二、实验室需要根本仪器设备,1.灭菌设备,B.枯燥箱：属于干热灭菌设备。用器皿、器械灭菌，不能用于培养基灭菌,二、实验室需要根本仪器设备,1.灭菌设备,C.紫外灯：利用紫外灯发出紫外光波杀菌。用于空气和环境外表灭菌。,二、实验室需要根本仪器设备,1.灭菌设备,D.过滤灭菌器：利用微孔膜和 过滤掉空气中微生物。,E.酒精灯：利用火焰高温灭菌。,二、实验室需要根本仪器设备,2.准备室其它设备,A.药品柜：,B.试验台：根据需要设置2个以上,C.冰箱：1-2只存放母液、试剂、试验材料,D.蒸馏水器：1套,E.木架：放置玻璃器皿,F.自来水、水池,二、实验室需要根本仪器设备,3.接种设备,A.超净工作台：单人、,双人，单面双面。原理,B.显微镜和解剖镜：,剥离茎尖和观察培养材料用。,C.酒精灯：,D.紫外灯：,E.接种工具：,镊子、接种针,剪刀、解剖刀,二、实验室需要根本仪器设备,4.,培养室设备,A.,培养架,B.,控温设备,a.,制冷 空调,b.,加热 加热器,c.,温控仪,C.,控光设备：,自动定时器控制光照时间,D.,恒温摇床：,用于液体培养,E.,光照培养箱或人工气候室,二、实验室需要根本仪器设备,4.培养室设备,G.培养皿：,培养瓶、三角瓶、,培养皿和试管等,玻璃、塑料聚碳酸脂,二、实验室需要根本仪器设备,配培养基所器皿设备,A.盛装容器：细口瓶棕色、白色,B.称量仪器：,电子天平称量激素,托盘天平称量蔗糖和琼脂,容量瓶、量筒、烧杯、,移液管、量杯等,C.电炉、微波炉：溶琼脂用,试纸或酸度计：检测pH值用,三、培养基及其配制,(一) 种类,(二) 培养基成分,三培养基母液,四培养基配制,(一)培养基的种类,培养基种类很多，迄今根本培养基的配方几百种，较常用的一二十种。,如：1MS、改进MS培养烟草用,2MT,3White 培养番茄,改进White生根培养,4 N6培养水稻,5 B5 培养大豆,6 Blaydes、,7 Nitsch,8 NT烟草叶肉原生质培养。,(二),培养基成分,(Inorganic nutrients),(1)大量元素 (Macro-elements),N：各种氨基酸、维生素、蛋白质和核酸的重要组成局部。,P：与核酸蛋白质合成密切相关，细胞分化增殖需要大量的P。,K：影响培养物中酶的活动。,镁是叶绿素分子的一局部；,钙是细胞壁的组成之一；Ca、S、Mg影响着培养物中酶的活动和新陈代谢的过程。,(二),培养基成分,2微量元素 Micro-elements,如：Fe、Na、Mn、Zn、B、Mo、Cu、Co、I。,锰：与植物呼吸作用和光合作用有关；,铁：有助于提高愈伤组织的诱导率和促进胚的发育；,硼：影响植物体内蛋白质的合成；,钠：植物组织中酶的组成成分，有防止叶绿素被破坏的作用。,(二),培养基成分,2.有机营养成分,1碳源,植物组织培养中，由于培养物的光合作用能力较弱，需要在培养基中附加碳水化合物作为生长发育所需的能源代谢原料，又可维持其一定的渗透压。,最常用的碳源是蔗糖，浓度一般为2%-5%。一般蔗糖为碳源时，离体的双子叶植物的根生长得最好，而以右旋糖葡萄糖时，单子叶植物的根生长得好。也可使用山梨醇、麦芽糖、甘露糖等。,(二),培养基成分,2.有机营养成分,2维生素,在植物细胞中主要以各种辅酶形式参与代谢活动。在植物组织培养中发挥很重要的作用。,VB1盐酸硫胺素：对愈伤组织形成有利。,VB6盐酸吡哆醇：能促进根的生长。,VMBC叶酸：是蛋白质和核酸合成的必需因子，在细胞分裂和繁殖中起重要作用；VB5烟酸：与植物代谢、胚的发育有关。,VC抗坏血酸：抗氧化，防止组织褐变。,(二),培养基成分,2.有机营养成分,3肌醇环己六醇：促进糖类转化，也是细胞壁的构建成分。,4氨基酸：是蛋白质组成局部，也是有机氮源。,5天然复合物：为了促进某些愈伤组织、器官生长。,如：椰乳、香蕉汁、马铃薯汁、苹果和番茄汁；,人参、西洋参粉；,蜂王浆、,(二),培养基成分,3.植物生长调节剂,1生长素,促进细胞生长与分裂，促进生根,IAA吲哚乙酸：,IBA吲哚丁酸,NAA萘乙酸,2,4-D二氯苯氧乙酸,2,4,5-T三氯苯氧乙酸,NOA萘氧乙酸,P-CPA对氯苯氧乙酸,副作用小，活力低，稳定性差，用的少。,多用于生根培养，,效果好，,与细胞分裂素互作促进芽增殖和生长。,对愈伤组织的诱导和生长效果好。但强烈抑制芽的形成，影响器官发育。,(二),培养基成分,3.植物生长调节剂,2细胞分裂素,促进细胞分裂与分化，诱导胚状体和不定芽形成，延缓组织衰老，促进蛋白质合成。,6-BA苄基腺嘌呤,KT冲动素,Zt玉米素,2-ip异戊烯腺嘌呤,(二),培养基成分,3.植物生长调节剂,3赤霉素,组培中所用的是GA3。与上面二类调节物质相比，不常使用。,A.可启动细胞分裂，促进细胞生长，打破休眠。,B.抑制器官发生：对组织培养中器官和胚状体形成有抑制作用。,C.促进形成器官生长：对已形成器官和胚状体生长有促进作用。,(二),培养基成分,3.植物生长调节剂,4其它种类,A.脱落酸ABA:抑制生长，促进体胚形成,B.多胺PA：调控器官发生,延缓原生质体衰老,C.多效唑PP333：促进植物矮化，分枝、生根,(二),培养基成分,4.凝固剂,配制固体培养基需要添加的物质。使培养基凝固成固体培养基，未加为液体培养基。,常用凝固剂有：琼脂粉或条，较常用。,用量：6-10g,明胶(gelatin )、琼脂糖agarose,琼脂特性：是从海藻中提取的高分子化合物。,溶于95左右热水成溶胶状,温度低于40时凝固成固体状态,(二),培养基成分,5.培养基中其它成分及作用,1) 活性炭,作用：吸附培养中有毒害物质，抑制褐变，减少玻璃化，促进生根。,用量：一般0.5-3%，会影响琼脂凝固度,2抗生素,抗生素作用：防止外植体内生菌污染。,种类：青霉素、链霉素、土霉素、四环素等,用量： 一般5-20 / L，,注意问题：,1.,不同抗生素对不同种菌抑制效果有差异,2.,有单用一种无效，必须几种配合使用才有效,3.,用时要考虑抑制杂菌效果和对植物不利影响,4.,停止使用抗生素后，污染会上升。,(二),培养基成分,5.培养基中其它成及作用,3抗氧化物,种类：VC、半胱氨酸、谷胱甘肽、柠檬酸等,作用：抑制外植体褐变。褐变是组织分泌酚类物质被氧化引起。这种氧化会毒害外植体。,4硝酸银,作用：抑制乙烯活性，防止组织衰老，促进器官和胚状体发生。,用量：一般1-10 / L，,注意：有一定副作用，不要长期将组织保存在含硝酸银的培养基中,12-2-2,(二),培养基成分,6.培养基中的pH值,范围： pH一般5.5-6.0,最常用pH,作用：,A.影响培养材料生长：pH和时，,生长会停滞。,B.影响培养基凝固： pH时，培养基会过硬，5.0 琼脂凝固下降，或不凝固。,温度对pH影响：经高温、高压灭菌后， pH会下降个单位。,检测：用精密pH试纸,调节：有1mol/L NaoH、HCI,三 培养基的制备,1.母液的配制与保存,为什么要配母液？,节省时间,便于称量,母液配属数：考虑稀释配培养基时方便,一般配母液是将培养基配方扩大10X、20X、100X或更高倍。,以MS培养基为例：,母液：,三 培养基的制备,1.母液的配制与保存,母液：大量元素1020,注意：按顺序溶解后再参加下一种，不要剩余,20,(,单独溶解,),三 培养基的制备,1.母液的配制与保存,母液：微量元素100200,注意：按顺序溶解后，再参加下一种，,一粒都能剩余，否那么浓度达不到要求,三 培养基的制备,1.母液的配制与保存,母液 ：铁盐100200,三 培养基的制备,1.母液的配制与保存,母液 ：有机成分100200,以配200x为例：,成分,1L,母液用量,（,mg/L,）,每升平培养基取用量,ml,肌醇,20000.00,5,烟酸,100.00,盐酸吡多醇,100.00,盐酸硫胺素,20.00,甘胺酸,400.00,三 培养基的制备,2.,激素母液的配制与保存,植物生长调节物质的贮备液需单独配制，激素母液配成,100X-500Xmg/L,。,由于多数植物激素难溶于水，用以下方法配制：,IAA、IBA,：,溶于少量95%酒精 加水定容,NAA,：,溶于少量95%酒精或少量1,NNaOH,加水定溶,2,4-,D,：,溶于少量1,N NaOH,加水定容,KT、BA,：,N-1N HCl,加水定容,GA,3,：95%,酒精,以上配好的母液需贮存于2-4的冰箱中，定期检查有无沉淀或微生物的污染，如发现霉菌、浑浊或沉淀，那么不能再用。,配制母液时应注意的事项,1. 浓度适宜,2. 按顺序称量,3. 原那么上应使每种成份分别溶解，一粒不剩，然后再把它们彼此混合。尤其是铁盐母液，否那么易产生沉淀。,4. 贴标签如MSI，10x，2021.9.18贮存于2-4，贮备时间不宜过长。,5. 铁盐液应贮存于琥珀色棕色玻璃瓶中，防氧化。,三 培养基的制备,3.培养基的配制,步骤如下：,1琼脂+蔗糖+H2O3/4V 加热溶解,2按比例依此参加母液、及生长调节物质和其它特殊补加物。遇热易分解的物质除外,注意计算好所要生长调节物质激素的用量,不要出现错误！,3加蒸馏水至最终容积定容,-1N NaOH或HCl调节pH。一般高压灭菌后 pH值会下降0.2,5分装100ml三角瓶，40ml/瓶，盖封严瓶口材料：锡箔，三层称量纸，棉塞等,kg/cm2，15-20min18min,配置好的培养基应尽快使用，常温下25一般放置1-2周，4黑暗下保存也不宜时间过长。,原因： 污染, 成分变化 如IAA易分解,高温高压消毒时,应注意,：,1. 高压消毒锅内须按规定加至一定量的水。,2. 消毒锅内不宜装得太满，以保证蒸汽能在锅中充分的循环。,kg/cm2时，翻开放气阀排净冷空气1-2kg/cm2，温度121下 维持15 20 min18 min 。,也可通过直接翻开放气阀加热排除锅内冷空气。,kg/cm2以下方可翻开放气阀，以免压力骤然改变而导致培养基冲出培养瓶。,灭菌法,物理灭菌,化学灭菌,湿热灭菌高压灭菌锅121，,kg/cm2，15-20min,干热灭菌烘箱160-180，1-3h,细菌滤膜um,射线紫外灯空气消毒,薰蒸甲醛和高锰酸钾,消毒剂次氯酸钙、氯化汞等,四、灭菌技术,五、外植体处理,1.材料来源,取自健壮植株，保证内部无菌。,2.外表消毒,如外植体外表污染很严重，须先用流水冲洗1h或更长的时间，后用外表消毒剂进行消毒。,一些外表消毒剂的消毒效果,消毒剂 使用浓度 消毒时间min 效果,次氯酸钙 9-10% 5-30 很好,次氯酸钠 2% 5-30 很好,过氧化氢 10-12% 5-15 好,溴水 1-2% 2-10 很好,硝酸银 1% 5-30 好,氯化汞 0.1-1% 2-10 满意,抗生素 4-50mg/L 30-60 相当好,在用杀菌剂处理之前先把植物材料在70%酒精70%酒精比其它浓度酒精更具渗透力和杀菌力，且易散发，但灭菌时间不易过长，否那么会杀死组织细胞。中浸数秒，或在消毒液里加上几滴外表活性剂，如Triton-X或Tween-80。灭菌处理时可磁力搅拌或人工屡次搅动，提高杀菌效果。,外表消毒处理之后，必须用无菌水将材料漂洗3-4次，以除掉所有残留的杀菌剂。,3. 无菌操作,植物组织培养中由于培养基中含有高浓度蔗糖，能供养很多微生物，,如细菌和真菌的生长。,一旦接触培养基，微生物的生长速度一般都比培养的组织快得多，最终将组织杀死。这些污染微生物还可能排泄对植物组织有毒的,代谢废物,。因此，无菌操作显得尤为重要，应严格按照无菌操作规程进行操作。,无菌操作前10,min,先使超净工作台处于工作状态，让过滤空气吹拂工作台和四周台壁。所有的操作工具包括培养皿、解剖刀、接种针、镊子和剪刀等事先均需用牛皮纸包好进行,湿热灭菌,。,本卷须知：,1入室前，先用肥皂洗手，指甲不宜过长。,2工作前穿上清洗干净的专用工作服消毒无菌服最好，戴上事先消毒的帽子、口罩。,3操作前用70%酒精擦洗双手，各类器械在操作前最好再次用火焰干热灭菌，并且在操作过程中时常进行灭菌，时常擦洗双手，防止双重传递污染。,4严禁操作时谈笑，防止唾沫中的细菌扩散引起污染。,5翻开培养容器塞子或盖子前，火焰烧瓶口，把灰尘固定在瓶口上，杀死菌类。因为试管在贮存时可能积聚了少量灰尘，在室温冷却时管口形成负压，当塞子拔开时，空气进入而带入灰尘。,6塞子应朝下放，以免灰尘落入。,7培养容器应拿成斜角，既减少灰尘和偶尔存在的细菌的落入，又便于操作。,8身体不宜进入超净台，以防头皮屑等落入培养基。,9操作应在酒精灯火焰旁边。,10不要与微生物工作者或病理工作者共用组织培养工作区。一旦发现污染，立即将污染的培养物拿出培养室进行处理。,细菌污染,：接种23天后即可发现，菌斑呈粘 液状；,真菌污染,：接种510天后，才能发现不同颜色的霉菌。,培养基污染有几个可能的来源,：,1培养容器,2培养根本身,3外植体,4接种室的环境,5接种或继代时用以操作植物材料的器械,6培养室的环境,六、培养条件,1.温度：一般设定25左右，,(15-35之间,2.光照：3000-4000lx(1000-6000lx),15-16h,3.气体：固体培养外植体放在外表，,液体振荡。,4.湿度：一般在70-80%，过低影响培养,基水分蒸发。,六、培养条件,5.,培养基的渗透压,用蔗糖来调解，多数适用范围,2-6%,，根分化,2-3%,，体细胞胚发生较高，不要超过,15%,。,6.,培养基的,pH,值,范围，多控制在。,七、继代培养,1.,作用,养分耗尽；,植物长满瓶；,培养基中有害物质过多；,减少污染；,12-3-9,七、继代培养,2.,驯化现象,逐渐减少生长调节剂的浓度，直到为,0.,七、继代培养,3.,衰退现象,植物生长能力下降，原因如下：,A.,植物种类差异：,草本,木本；,被子,裸子；幼龄,老龄；胚,营养体组织；,B.,培养条件：主要是培养基差异。,C.,继代次数：一般次数多表现明显。,D.,培养季节：一般春天,夏天,秋天,八、驯化移栽,The end,一个用来存放天平,天平精确度,1/10,g,蔗糖、琼脂,1/100,g,大量元素,1/10000,g,微量元素、植物激素、有机物,一个用来配制试剂和培养基,某些生长调节物质如GA3、玉米素、ABA、某些维生素等，遇热易分解，不能进行高压灭菌，用过滤或抽滤灭菌。,铬酸洗液配方：40g工业用重铬酸钾 参加500ml水溶解 缓缓参加粗制浓硫酸450ml。,可反复使用，直至呈青褐色时为止。为一强氧化剂，腐蚀性强，洗涤时需注意。,m的颗粒，这种不带真菌和细菌的超净空气流24-30m/min可吹跑所有的空气流，确保一个完全无菌的环境。,驱尽锅内空气前提下，通过加热，把密闭锅内纯水蒸汽的压力升高而使蒸汽温度相应提高，依靠温度而非依靠压力到达灭菌的目的！,氯化汞消毒后汞离子不易被清洗尽，易损伤外植体。,湿热灭菌比干热灭菌有效,，,原因：, 湿热易于传递热量；, 湿热更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构，加速其变性。,