第三章 电泳技术-张静

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第三章 电泳技术,电泳技术的基本知识,一、定义 电泳,带电粒子在直流电场中向着电性相反的电极方向移动的现象。,电泳技术,利用电泳现象进行物质分离的技术。,应用电泳技术可以使许多复杂高分子化合物如,蛋白质、酶、核酸,等进行分离，还可用于某种物质,纯度分析,，结合其他层析法等分离技术可以提高对物质的,结构分析和鉴别能力,，所以电泳技术已成为生物化学与分子生物学的科学研究的重要工具。,二、电泳技术发展概况,1809,年 发现电泳现象,1937,年 建立自由界面电泳,1948,年 建立滤纸（区带）电泳,1950,年建立醋酸纤维素薄膜电泳,1959,年创建聚丙烯酰胺凝胶电泳,1980,年建立毛细管电泳,第一节,电泳的基本原理,电泳技术就是利用在电场作用下，由于待分离样品中各种分子,带点性质,、,分子大小,和,形状,等性质的差异，使带电分子产生不同的,迁移速度,，从而对样品进行分离、鉴定或提纯。,迁移率与分子所带,净电荷,成正比，与,分子的大小和缓冲液的黏度,成反比 。,质点运动的力（,F,）,等于,质点所带净电荷量,（,Q,）,与电场强度（,E,）的乘积,F = QE,摩擦阻力（,F,）等于,r,为质点半径,与,为介质粘度和,为质点移动速度的乘积,F=6,r,v,当,F,F,时 即,6r,QE,v=,Q E,6,r,迁移率（,Mobility),带电颗粒在,单位电场强度,下的泳动速度。,M =,-,V,E,=,-,Q,6,r,u =,-,6,r,Q,影响电泳的主要因素,（一）电泳介质（电泳支持物）,（二）缓冲液的,pH,值及离子强度,（三）电场强度,（,四）电渗作用,（五）样品本身：带电、大小、形状,（一）电泳介质（支持物）的影响,常用的支持物主要有：,纤维薄膜,(,玻璃纤维薄膜，醋酸纤维薄膜,),、,凝胶,(,琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶,),和,滤纸,等。,这些支持物为,多孔,结构，多孔支持物表面可吸附水中的正或负离子使溶液相对带电，在电场作用下，溶液就会向一定方向移动，这种在电场作用下液体对固体支持物相对移动的现象称为,电渗,。若电渗作用的方向和电泳作用的方向一致，则物质移动是电渗和电泳作用之和，反之是二者作用之差。,凝胶支持物结构的孔隙对带电颗粒分子产生阻力，分子大的在凝胶中泳动速度慢，分子小的泳动速度快即称,分子筛效应,。,（二）缓冲液的,pH,值及离子强度的影响,pH,值：,溶液的,pH,值决定样品解离的程度，即所带净电荷的多少。,对蛋白质而言，,pH,值离,pI,越远，则带净电荷越多，泳动速度越快，反之则越慢，因此应选择合适的,pH,，使各种蛋白质所带电荷差异较大，有利于彼此分开，为了使电泳过程溶液,pH,值恒定，必须采用具有一定缓冲能力的缓冲溶液。,离子强度：离子强度影响电动势（双电层），溶液的离子强度越高，电动势越小，则电泳速度越慢，反之，则越快，一般最适的离子强度在,0.02,0.2,之间。,计算方法为：,I = CZ,2,I,为离子强度，,C,为离子的摩尔浓度，,Z,为离子的价数。,离子强度过低，溶液的缓冲能力减弱，不易维持所需,pH,值，反而会影响颗粒带电荷状态影响电泳。,1,2,（三）电场强度的影响,电场强度是指每一厘米支持物上的电势差，也称电势梯度。,以纸电泳为例：滤纸长,15,厘米，两端电势差为,150,伏特，则电场强度为,150,伏特,/15,厘米,10,伏特,/,厘米。,电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快，反之则越慢。,电场强度越大，电流将随之增加，产热也增加，影响分离效果。,在进行高压电泳时必须用冷却装置。,（四）电渗作用的影响,在电场的作用下缓冲溶液对于固体支持物的相对移动称为电渗作用。,例如在纸电泳中，由于滤纸的纤维素带负电荷，因感应作用使与滤纸相接触的水溶液带正电荷，带正电荷的液体向负极移动，从而影响样品的移动。,电渗与样品移动的方向相同，,V,变大；反之变小。, ,+,-,液相,固相,电渗流,电渗示意图,（五）样品本身的影响,带电量、分子量、分子形状,Q,越多，,V,越大；,r,越小，,V,越大；,球形分子,纤维状分子,五、电泳的分类,目前的电泳方法，大致可分为三类：,1,、显微电泳 在微管中进行,2,、自由界面电泳 在溶液中进行,3,、区带电泳 在支持物中进行,其中区带电泳应用比较广泛,毛细管电泳仪系统,Come on,(,一,),按支持物的物理性状不同可分为：,区带电泳分类如下：,1,滤纸及纤维薄膜,(,如玻璃纤维、醋酸纤维、聚氯乙烯纤维薄膜,),电泳。,2,凝胶电泳：如琼脂、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶电泳。,3,粉末电泳：如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳。,4,线丝电泳：如尼龙丝、人造丝电泳，此为微量电泳方法。,(,二,),按支持物装置形式不同，区带电泳可分为；,1,平板式电泳：支持物水平放置，是最常用的电泳方式。,2,垂直板式电泳：如聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳。,3,垂直柱式电泳：如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳。,聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图,(A,为正面,B,为剖面,),(,三,),按,pH,的连续性不同，区带电泳可分为：,1,连续,pH,电泳：即整个电泳过程,pH,保持不变，如常用的纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳等。,2,非连续,pH,电泳：缓冲液和电泳支持物间有不同的,pH,的电泳，如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳，等电聚焦电泳等。,（四）根据被分离样品的量多少,分析电泳,制备电泳,（五）根据电泳电压的高低,常压电泳,0,500 V,高压电泳,500,3000V,六、电泳装置,主要包括两个部分：电源和电泳槽,电源（电泳仪）提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。,电泳槽是电泳分离的场所 重要，,最好要专用。,可以分为水平式和垂直式两类。,第二节 纸电泳,以,滤纸为支持体的电泳技术,操作要点：,1,选择缓冲液,挥发性强,对显色剂和紫外光吸收等观察区带的方法无影响,A,分离蛋白质，,pI,5,，选,pH8.6,的缓冲液（巴比妥缓冲液,pH8.6,、,硼酸,pH8.6,、,磷酸,pH7.4),B,分离氨基酸：邻苯二甲酸氢钠、磷酸,醋酸，,pH5.9,C,分离核苷酸，选巴比妥醋酸,pH2.5,，,柠檬酸,pH23,D,分离糖类：,HAC-,NaAC, pH35,2,滤纸的选择与处理,层析用滤纸，纸宽,2,3cm/,样品组分，长短影响电场强度。,3,点样,点圆点（量少）、点条状（一般），点中间（未知样品）、点一边（已知样品）,干法、湿法,4,电泳,电桥水平、加盖、电压稳定、注意时间,5,显色及分析,蛋白：溴酚兰、氨黑,10B,、,偶氮胭脂红,B,Aa,：,茚三酮、靛红,核酸：紫外光下观察,第三节 薄层电泳,将,支持物与缓冲液调制成适当厚度的薄层进行电泳。,常用支持物：淀粉（最常用）、琼脂、纤维素粉、硅胶等,以淀粉薄层电泳为例，介绍操作步骤：,1,缓冲液选择,离子强度较高的缓冲液,2,支持物处理,精制品,3,薄层板制作,铺蜡纸,-,放框架,-,倒入淀粉与缓冲液混合液,-,静置,10,小时,-,除上清,-,淀粉表面稍干,-,去除框架,-,即可。,4,加样：挖沟,-,混合样品,-,填埋,5,电泳,6,分析：印染法,第四节 薄膜电泳,以乙酸纤维素等膜材料为支持物进行的电泳。,优点,：简便、快速、区带清晰、无拖尾、易回收定量、分辨力较高、便于保存,缺点：,分辨率较低,薄膜电泳的操作步骤,1,薄膜的处理与放置,2,点样,平衡,3,电泳：,E 1025V/cm,，,0.5,2h,4,显色,醋酸纤维素薄膜电泳装置,醋酸纤维素薄膜电泳的应用：,医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。,特点：由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。,第五节 凝胶电泳,凝胶电泳主要分为：,聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳，,琼脂糖凝胶电泳主要应用于核酸的分离纯化，,聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于蛋白质和小分子核酸、,广泛应用于生物化学、分子生物学、免疫学、,临床化学、药学等学科的研究。,凝胶电泳主要分为：,聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳。,琼脂糖凝胶电泳主要应用于,核酸,的分离纯化；,聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于,蛋白质和小分子核酸,核苷酸,的分离。,1,、机械强度高，透明,2,、原料成分纯度高，制凝胶的重复性好,3,、凝胶孔径可调,4,、化学稳定性和热稳定性好,5,、电渗作用小,6,、电泳分辨率高,一、聚丙烯酰胺凝胶的性能和制备原理：,(,一,),性能：,(,二,),制备原理,聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体,(,Acr,),和少量的交联剂甲叉双丙烯酰胺,(,Bis,),，在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。,聚丙烯酰胺凝胶的聚合体系有两种：,化学聚合,： 采用,过硫酸铵,为催化剂，,四甲基乙二胺,(TEMED),为加速剂，在,TEMED,催化下，过硫酸铵形成自由基,SO,4,-,，后者可使丙烯酰胺单体的,双键打开,，活化形成自由基丙烯酰胺，从而引起聚合作用。,光聚合,： 用,核黄素,作催化剂，核黄素在光照下分解成,无色基,，后者再被氧化成自由基而引发聚合作用。日光灯光源、直接日光或室内强散射光均可，当加入,TEMED,后能促进聚合。,光聚合,形成的凝胶孔径较,大,(,大孔径,),，,且随时间的延长而逐渐变小，不太稳定，多用于制备浓缩胶,。,(3),凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系：,凝胶浓度,(T,),是指,100ml,凝胶中含丙烯酰胺单体,(,Acr,),和甲叉双丙烯酰胺,(,Bis,),的总克数。一般,T,愈,大,则胶愈,硬,也易脆裂，,T,过小，则胶稀软不易操作。,交联度,(C,),是指,Bis,占凝胶总克数的。,C,过,高,不仅胶变,脆,缺乏弹性且,透明度降低,；,C,过低则胶聚合不良呈糊状。,Acr,与,Bis,量还影响胶的孔径大小，因此必须根据样品分子的大小选择凝胶配方：一般情况下，体内蛋白质多采用,7.5,浓度凝胶，所得电泳结果是满意的。,聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理,聚丙烯酰胺凝胶中制有,2-3,种不同的凝胶层，最上层是,样品胶,，中层是,浓缩胶,，这两层均为,大孔,胶，用,Tris-HCl,缓冲液，,pH,值,6.7,，最下层是,分离胶,(,又称电泳胶,),，该层为,小孔,胶，用,Tris-HCl,缓冲液，,pH,值,8.9,。在上下两电泳槽中以,Tris,一甘氨酸,为缓冲液，,pH,值,8.3,。这样造成凝胶层、缓冲液、,pH,值及电场强度的不连续性，在这样的凝胶系统中存在三种效应。,不连续凝胶电泳示意图,Tris,一甘氨酸为缓冲液，,pH,值,8.3,。,Tris,一甘氨酸为缓冲液，,pH,值,8.3,Tris-HCl,缓冲液，,pH,值,6.7,Tris-HCl,缓冲液，,pH,值,8.9,（一）浓缩效应,在样品胶与浓缩胶中进行。在,pH,值,6.7,中,HCl,全部解离；多数,Pr,的,PI,为,5,左右，解离度次之；甘氨酸的,PI,为,6,，解离度最小，即这两层胶中含有,C1,-,、蛋白质和甘氨酸三种负离子，通电后三者均向正极移动，但迁移率,(),不同，,Cl,-,蛋白质,甘氨酸，电泳时,C1,-,泳动速度最快,(,称快离子,),：其次为蛋白质，最慢的是甘氨酸,(,称慢离子,),。由于,C1,-,快速向正极移动，在它后面形成一个离子浓度低的,低电导区,，,低电导区形成高电位梯度,。,于是使蛋白质和慢离子也紧跟快离子快移，形成三种离子移动界面，,蛋白质夹在中间被浓缩成一薄层,，如原来,lcm,厚的样品可被压缩成,25m,的厚度。,当进入,pH8.9,的分离胶时，,Gly,解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；因此,Cl,-,及,NH2CH2COO-,沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于相对分子质量大，被留在后面，逐渐分成多个区带。,(,二,),电荷效应：,在分离胶中进行，在高度浓缩的蛋白质薄层中，由于各种蛋白质分子的,pI,不同，所带电荷不同，其迁移率也不同，各种蛋白质就按迁移率的快慢顺序而分离。,(,三,),分子筛效应：,分子量或形状不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时所受的摩擦力不同，受阻滞的程度不同。因此表现出不同的泳动率即分子筛效应。即使静电荷相同的蛋白质，也会由于分子筛效应在分离胶中被分开。,分子量小阻力小移动快；分子量大阻力移动慢。,电荷多迁移率大，电荷少迁移率小。,注意事项 ：,(1)Acr,、,Bis,是神经性毒剂，并对皮肤有刺激作用，操作时应特加小心或带医用于手套，避免与皮肤接触。,(2),电泳完毕后，上下槽电泳缓冲液不能混匀再使用，因离子强度和,pH,都已发生变化。,(3),凝胶聚合的时间与温度有关：夏天聚合快可放冰浴，冬天室温,10,聚合时间将延长。,SDS-,凝胶电泳原理,聚丙烯酰胺凝胶系统中加入,SDS,，蛋白质电泳迁移率取决于其分子量，而与形状及所带电荷无关。,加入,SDS,和巯基乙醇后，巯基乙醇使蛋白质二硫键还原，,SDS,使氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质,-SDS,，,带上相同密度负电荷，形状为长椭圆形，短轴一定，长轴长度正比于蛋白质分子量。,分离测定：,测分子量（与标准蛋白比较）,鉴定样品纯度（条带数目）,测定样品蛋白质含量：扫描定量（比色）,凝胶电泳的操作要点,1,凝胶制备,2,电极缓冲液,3,样品处理及加样,4,电泳,5,染色与固定,6,脱色,7,分析,电泳装置,电泳系统中加进两性电解质载体，当通以直流电时，两性电解质载体即形成一个,由阳极到阴极连续增高的,pH,梯度,。蛋白质进入时，不同的蛋白质移动到与其等电点相当的,pH,位置上，从而使不同等电点的蛋白质得以分离。,优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，可测定蛋白质或多肽的等电点。,缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性的蛋白质。,第六节 等电点聚焦电泳,1,、,pH,梯度形成的机制,载体两性电解质既有酸性基团(,NH,2,)，,也有碱性基团(,COO,)，,既可接受质子，也可释放质子。,在制备聚丙烯酰胺凝胶时，将其混溶其中。电泳时凝胶板,正,极的电极液是,磷酸,，,负,极是,氢氧化钠,。,正极是酸性环境，载体两性电解质都带正电荷，但由于,p,I,的不同，其所带正电荷数量就有所差异，电泳时，向负极泳动的速度也就因此不同。,负极是碱性环境，载体两性电解质带有数量不等的,负,电荷，以不同速度向,正,极泳动。,在泳动过程中又不断地与溶液交换质子，改变了溶液的,pH。,当达到平衡时，不再出现质子的交换时，载体两性电解质到达等电点并各处于自己的,p,I,区域，不在移动。,所以，溶液也因此呈现不同的,pH，,随载体两性电解质的,p,I,梯度而形成,pH,梯度。,2,、两性电解质载体,两性电解质载体是用,多烯多胺,和,不饱和酸,合成的,脂肪族多氨基多羧基化合物的混合物,，其中不同的分子因氨基和羧基比例不同而具有不同的,pI,。,目前，两性电解质载体由于生产厂家不同，合成方式各异而有不同的商品名称，如,Ampholine(LKB,公司)、,Servalyte,(,德国,Serva,公司)、,Pharmalyte(Pharrnacia,公司)。国,内生产的均称为两性电解质载体，生产厂家有上,海东风生化试剂厂、北京军事医学科学院等,。,一般溶液浓度为,40或20，,其,pH,范围分别为：,2.55，46.5，58，6.59，810.5，310,等。,CH,2,=CH,C,O,O,H,CH,2,-,CH,2,NH,CH,2,-,CH,2,NH,CH,2,-,CH,2,NH,R,NH,R,( ),n,CH,2,-,CH,2,NH,CH,2,-,CH,2,NH,CH,2,-,CH,2,N,R,NH,R,( ),n,CH,2,CH,2,C,O,O,H,CH,2,CH,2,C,O,O,H,随机加成,多胺同系物,丙烯酸,加成度不同的混合物，分子量大小不同，胺基和羧基的比例不同。,两性电解质载体制备,两性电解质载体,是,IEF-PAGE,中,最关键的试剂,，它直接影响,pH,梯度的形成及蛋白质的聚焦。,因此，要选用优质两性电解质载体，在凝胶中，其终浓度一般为,12,。,pH,梯度,的线性依赖于,两性电解质的性质,，选择哪种,pH,梯度范围的两性电解质载体，则与被分离蛋白质的,pI,有关。,3,、,pH,梯度支持介质,常用的pH梯度支持介质有聚丙烯酰胺凝胶、,琼脂糖凝胶,、葡聚糖凝胶等，其中聚丙烯酰胺凝胶为最常应用。,琼脂糖凝胶,（,agarose gel,），,依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝胶在,40以上,开始融化,。,举例：等电聚焦电泳分离蛋白质,一,、仪器与试剂,1,仪 器,：,JY5000,电泳仪、,DYCP32,型电泳槽,2,试,剂,：,蛋白质样品、载体两性电解质、,琼脂糖、溴酚蓝、蒸馏水,电极液,：,0.5M,醋酸溶液,（阳极液）、,0.5M,氢氧化钠溶液,（阴极液）,等电聚焦电泳分离蛋白质,二,、操作步骤：,1,、配胶,胶液组成：载体两性电解质（,pH3.5-9.5,）,1.0mL+,样 品,+,溴酚蓝一滴,+,蒸馏水,8.5mL+,琼脂糖,0.1g,2,、灌胶,将胶液升温至,75,，,保温,将胶液灌到塑料管中。灌胶过程注意,不要产生气泡,。冷却两小时后可接入电泳池。,等电聚焦电泳分离蛋白质,3,、加电极液,阴阳两极分别加入,80mL,电极液。阳极：,0.5M,醋酸溶液，阴极：,0.5M,氢氧化钠溶液。两边均需,没过胶管头,。,4,、电泳,使用,JY5000,电泳仪，调整电流，使功率保持在,1-2W,左右。电流开始较大，聚焦过程有所下降。当每条管中的,溴酚蓝集中成一点时，停止电泳,。整个电泳过程约,6,个小时。,等电聚焦电泳分离蛋白质,5,、样品收集,将胶管以溴酚蓝点为中心，分别切为,1cm,的小段。然后将胶管中的胶体分别挤入,5mL,的离心管中，每个离心管分别加入,4mL,去离子水，在,90Hz,下超声,3,小时。,用于进一步检测。,等电聚焦电泳分离蛋白质,三、注意事项,1,、两性电解质是等电聚焦的关键试剂,它的含量,1,-,2,较合适,。,使用完毕之后，请,及时放入冰,箱中保存,。,2,、灌胶过程中，注意塑料管中,不能有气泡,，否则电,泳时离子无法通过。,3,、电泳时，电泳槽中一定要,加上盖子,，否则胶体会,胀出塑料管外 。,4,、所有水都用,去离子水,。,5,、电泳过程中，功率是不断变化的，要注意随时调,整。,