第三章 蛋白质化学

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第二章蛋白质化学,BEA Confidential. |,1,第一节蛋白质（,protein,）的生物学功能,蛋白质的重要生物学功能,其他生物学功能：营养蛋白，结构，毒蛋白,第二节蛋白质的分子组成,一、元素组成,1,、主要元素：,碳、氢、氧、氮和硫，有些蛋白质还含有少量磷和金属元素。,2,、特点：,各种蛋白质的含氮量很接近，平均含氮量为,16%,。,3,、定氮法测定蛋白质含量：,蛋白质含量,6.25,样品含氮量,二、结构单位,氨基酸,（,amino acid,）,1,、蛋白质的结构单位,蛋白质基本结构单位：,L,氨基酸,氨基酸：脯氨酸（亚氨基酸）除外,L,氨基酸：甘氨酸（无不对称,C,）除外,氨基酸结构通式：,RCH(NH2)COOH,常见氨基酸种类：,20,种。,小结,2,、,氨基酸的分类,根据,R,的化学结构,（,1,）脂肪族氨基酸：,1,）疏水性：,Gly,、,Ala,、,Val,、,Leu,、,Ile,、,Met,、,Cys,；,2,）,极性：,Arg,、,Lys,、,Asp,、,Glu,、,Asn,、,Gln,、,Ser,、,Thr,（,2,）,芳香族氨基酸：,Phe,、,Tyr,（,3,）,杂环氨基酸：,Trp,、,His,（,4,）,杂环亚氨基酸：,Pro,根据,R,的极性,（,1,）极性氨基酸：,1,）不带电：,Ser,、,Thr,、,Asn,、,Gln,、,Tyr,、,Cys,；,2,）,带正电：,His,、,Lys,、,Arg,；,3,）带,负电：,Asp,、,Glu,（,2,）,非极性氨基酸：,Gly,、,Ala,、,Val,、,Leu,、,Ile,、,Phe,、,Met,、,Pro,、,Trp,2,、氨基酸分类：,按其侧链,的结构和理化性质分类,非极性、疏水氨基酸,(,非极性,R,基氨基酸,),：,Val,Leu, Ile,（支链）；,Gly,（无旋光异构）；,Met,（含硫）；,Phe,（芳香族）；,Pro,（亚氨基）,极性、中性氨基酸,(,不带电荷的极性,R,基氨基酸,),：,Ser,Thr,（含羟基）；,Tyr,Trp,（芳香族）；,Cys,（含硫）；,Gln,Asn,（含酰氨）,酸性氨基酸（含有两个羧基）：,Glu,（含,羧基）、,Asp,（含,羧基）,碱性氨基酸（含有两个以上氨基）：,Arg,（胍基）、,His,（咪唑基）、,Lys,（,氨基）,含硫氨基酸：,Met,、,Cys,芳香族氨基酸：,Phe,、,Tyr,、,Trp,三、氨基酸的理化性质,1,、物理性质,2,、两性解离,等电点（,isoelectric,point,pI,）：在某一,pH,环境中，氨基酸解离成阳性离子及阴性离子的趋势相等，所带,净电荷为零,，在电场中不泳动。此时，氨基酸所处环境的,pH,值,称为该种氨基酸的等电点,(,pI,),。,(,zwitterion,),等电点计算,侧链为非极性基团或虽为极性基团但不解离的氨基酸：,pI,=(pK,1,+pK,2,),酸性氨基酸,(,Glu,、,Asp),及,Cys,：,pI,=(pK,1,+pK,R,),碱性氨基酸,(,赖、精、组,),：,pI,=(pK,2,+pK,R,),带电状态判定,pI,-pH0 .,带正电,pI,-pH,0 .,不带电,3,、紫外吸收：,Trp,、,Tyr,和,Phe,在,280nm,波长附近具有最大吸收峰，其中,Trp,的最大吸收最接近,280nm,4,、化学反应：,（,1,）茚三酮反应,其他反应：荧光胺反应、侧链特异基团反应,例外：,Pro,黄色；,Asn,棕色,茚三酮反应,（,2,）与甲醛的反应：氨基酸的甲醛滴定法,RCHCOO,-,NH,3,+,RCHCOO,-,NH,2,+,H,+,OH,-,中和滴定,HCHO,RCHCOO,-,NHCH,2,OH,HCHO,RCHCOO,-,N(CH,2,OH),2,（,3,）与,2,4-,二硝基氟苯,(DNFB),的反应,NO,2,F,O,2,N,+ H,2,NCHCOOH,R,NO,2,O,2,N,HNCHCOOH,R,+ HF,弱碱性,DNP-,氨基酸,H,2,NCHCOOH +,R,N,CH,3,CH,3,O=S=O,Cl,5-,二甲氨基萘磺酰氯（,DNS-,Cl,）,pH9.7 40,N,CH,3,CH,3,O=S=O,HNCHCOOH,R,DNS-,氨基酸,取代,DNFB,测定蛋白质,N,端氨基酸，灵敏度高,（,4,）与异硫氰酸苯酯（,PITC,）的,反应,N=C=S +,NCHCOOH,H,H,R,PITC,NC,NCHCOOH,H,H,R,S,PTC-,氨基酸,NC,H,R,S,N,C,C,O,PTH-,氨基酸,pH8.3,无水,HF,重复测定多肽链,N,端氨基酸排列顺序，设计出“多肽顺序自动分析仪”,（,5,）与荧光胺反应：,根据荧光强度测定氨基酸含量（,ng,级）。激发波长,x,=390nm,，,发射波长,m,=475nm,。,（,6,）与,5,5-,双硫基,-,双（,2-,硝基苯甲酸）反应,：,H,2,NCH,CH,2,S,SH,NO,2,HOOC,S,NO,2,COOH,COOH,+,S,S,NO,2,NO,2,HOOC,COOH,H,2,NCHCOOH +,CH,2,SH,pH8.0,硫代硝基苯甲酸,测定,Cys,含量（,pH8.0,412nm,的摩尔消光系数,=13600,）,（,7,）、成肽反应：,第三节蛋白质的分子结构,一、蛋白质的基本结构形式,1,、连接方式：,肽键,肽键,(peptide bond),：一个氨基酸的羧基与另一氨基酸的氨基缩水而成的酰胺键称为肽键。（,CONH,）,肽平面,(peptide unit),：由肽键中的四个原子和与之相邻的两个碳原子共同构成的刚性平面。（,C,CONHC,）,2,、肽分类、命名,3,、生物活性肽：,谷胱甘肽,神经肽：脑啡肽、内啡肽、强啡肽、,P,物质、,Y,肽,肽类激素：催产素、加压素等,其他：生长因子；短杆菌,S,；甜味肽等,4,、蛋白质的基本结构形式：,多肽链,(NHCHCONHCHCO),多肽链的方向性：从,N,末端指向,C,末端。,二、蛋白质的一级结构,(primary structure),一级结构是指蛋白质的多肽链中氨基酸的排列顺序；主要靠肽键维系。,二四级结构称为蛋白质的空间结构，或空间构象；主要靠次级键维系，尤其是疏水键。,一级结构体现生物信息：,20,n,.,多样,一级结构是空间结构及生物活性的基础,.,特异,一级结构的连接键：肽键（主要）、二硫键,一级结构确定的原则,：将大化小，逐段分析，制成两套肽片段，找出重叠位点，排出肽的前后位置，最后确定蛋白质的完整序列。,目前往往采用从待测蛋白质的基因序列反推出蛋白质的一级结构。,1.,样品纯化（纯度,97%,以上）；,2.,测定蛋白质的分子量；,3.,末端分析,N,端分析：,PITC,法,(,Edman,法,),DNFB,法,DNS-CL,法,C,端分析：,肼解法,羧肽酶法,4.,拆分多肽链,:,可用,8mol/L,尿素或6,mol/L,盐酸胍处理,5.,用两种以上方法,特异性裂解：,肽链内,切酶（,胰蛋白酶,）,化学试剂（,溴化氰,）,6.,分离纯化肽段：双向电泳,7.,测定氨基酸组成 ：,氨 基酸自动分析仪,(,峰图）,8.,跨切口重迭肽段，,分析氨基酸顺序,一级结构测定的程序,PITC,法测定,N-,端氨基酸残基,DNFB,法分析,N-,端氨基酸残基,Edman,降解法测定氨基酸序列,异硫氰酸苯酯,用途,：,末端基氨基酸测定,AA,与,丹磺酰氯的反应,肼解法分析,C-,端氨基酸残基,NH,2,-NH,2,NH-NH,2,羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的,C-,端逐个的水解。,羧肽酶,A,能水解除,Pro,Arg,和,Lys,以外的所有,C-,末端氨基酸残基；,根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的,C-,末端残基顺序。,羧肽酶法分析,C-,端氨基酸残基,羧肽酶,B,只能水解,Arg,和,Lys,为,C-,末端残基的肽键。,蛋白质的特异裂解,胰蛋白酶（,trypsin,),的裂解作用,BrCN,的裂解作用,氨基酸自动测序仪,蛋白质一级结构的测定,测定多肽链的数目,蛋白质测序,的步骤,拆分多肽链,断开多肽链内的二硫键,测定每一肽链的氨基酸组成,鉴定多肽链的,N-,末端和,C-,末端,裂解多肽链为较小的肽段,测定各肽段的氨基酸序列,利用重叠肽重建完整多肽链的一级结构,确定二硫键的位置,蛋白质测序的重要方法,N-,末端测定,二,硝基氟苯（,DNFB,）法：,肽游离末端,NH2,与,DNFB,反应生成,DNP-,肽，最后水解生成黄色,DNP-,氨基酸,丹磺酰,氯（,DNS,）,法：,用,DNS,取代,DNFB,，,生成,DNS-,氨基酸,苯异硫,氰酸（,PITC,）,法：,生成,PTH-,氨基酸，从肽上断裂下来,氨肽酶,法：,外切酶，但效果不好,C-,末端测定,肼,解法：,测定,C-,末端的最重要的化学方法，肽与肼反应，除,C-,末端氨基酸游离外，其他氨基酸转变为氨基酸酰肼化物,还原法：,C-,末端氨基酸用硼氢化锂还原成相应的,-,氨基醇,羧肽酶,法：,最有效、最常用,羧肽酶A,羧肽酶,B,羧肽酶C,羧肽酶,Y,二硫键的断裂,过,甲酸氧化法：,将二硫键氧化成磺酸基,巯基,化合物还原法：,将二硫键还原成巯基，然后用烷基化试剂如碘乙酸保护巯基，防止其重新被氧化,氨基酸组成的测定：,酸,水解：,是主要方法，多用,HCl,，,同时辅以碱水解；所得氨基酸不消旋，但,Trp,全部被破坏，,Ser,，,Thr,，,Tyr,部分破坏，,Asn,和,Gln,的酰,氨基被水解，生成,Asp,和,Glu,；,多肽链的,裂解,酶,裂解：,胰蛋白酶：,专一性强，断裂,Lys,或,Arg,的羧基参与形成的肽键,糜,蛋白酶：,断裂,Phe,，,Trp,，,Tyr,，,Leu,等疏水,氨基酸的羧基端肽键,嗜热菌,蛋白酶：,专一性差，断裂,Val,，,Leu,，,Phe,，,Tyr,，,Trp,等氨基参与形成的肽键,胃蛋白酶：,在酸性条件稳定，肽键 两侧均为疏水氨基酸。在确定二硫键位置时，常用到此酶。,其它酶：略,化学裂解：,溴化,氰（,CNBr,）：,只断裂,Met,的羧基形成的肽键,羟,氨（,NH2OH,）：在,pH9,时，专一性断裂,Asn-Gly,之间的肽键，其它条件下不专一,肽段的,氨基酸测序,Edman,化学降解法：,用,Edman,试剂,PITC,与游离氨基作用生成,PTH-,氨基酸，并可用各种层析技术分离；用此法降解，一次可连续测出,60-70,个氨基酸残基的序列；工作量大，操作麻烦；现改用蛋白质测序仪。,酶,解法：,利用氨肽酶和羧肽酶，局限性大，有困难,质谱,法：,质谱仪,由,核苷酸序列推定法：,mRNA,cDNA,，,推出,cDNA,的核苷酸序列，然后推测出蛋白质的氨基酸序列,肽段在,肽链中次序的确定：,需借助重叠肽。,重叠肽：,由于不同的断裂方法即断裂的专一性不同，产生的切口彼此错位，使两套肽段正好跨过切口而重叠的肽段；获得重叠肽需要两种或两种以上的不同方法断裂同一多肽样品，得到两套或多套肽段。,二硫,键位置的确定：,一般采用胃蛋白酶水解原来的含二硫键的蛋白质。一是胃蛋白酶专一低，切点多，得到含有二硫键的肽段较小，易分离鉴定；二是在酸性条件下，有利于防止二硫键发生交换反应。,三、二级结构,蛋白质的二级结构是指,多肽链骨架,中原子的,局部空间,排列，,不涉及侧链,的构象，也就是该肽段主链骨架原子的相对空间位置，主要有,-,螺旋、,-,折叠、,-,转角和无规则卷曲,。维持二级结构的力量为,氢键,。,1,、,-,螺旋,(-helix),右手螺旋：,3.6,个,AA/,圈，螺距,0.54nm,；,氢键维系：链内氢键（,AA,1,AA,4,），平行长轴；,侧链伸出螺旋,2,、,-,折叠,(-pleated sheet),2,、,-,折叠,(-pleated sheet),多肽链充分伸展，肽平面折叠成锯齿状；,侧链交错位于锯齿状结构的上下方；,氢键维系：氢键的方向垂直长轴；,可有顺平行片层和反平行片层结构。,3,、其它,（,1,）肽链主链出现的,180,回折部分称,-,转角。,（,2,）蛋白质分子中那些没有确定规律性的部分肽链构象称为无规卷曲。,影响二级结构形成的因素,次级键介导蛋白质高级结构形成,四、超二级结构、域结构,1,、超二级结构,(,supersecondary,structure ),（,1,）基序或模序（,motifs or modules,，模体符）,在许多蛋白质中，有两个或三个具有二级结构的肽段在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，称为模序。有的将这种规则的二级结构的聚集体称为超二级结构，它们可直接作为三级结构的“建筑块”或域结构的组成单位，是蛋白质发挥特定功能的基础。,（,2,）类型：,、,、,、锌指结构、亮氨酸拉链,2,、域结构（,domain,，结构域）,域结构是在较大的蛋白质分子中所形成的两个或多个在空间上可明显区别的局部区域。结构域具有独特的空间构象，与分子整体以共价键相连，并承担特定的生物学功能。,结构域与分子整体以共价键相连,具有相对独立的空间构象和生物学功能,同一蛋白质中的结构域可以相同或不同，不同蛋白质中的结构域也可能相同或不同,五、三级结构,蛋白质的三级结构是指在一条多肽链中所有原子的整体空间排布，包括主链和侧链。三级结构的形成使得在序列中相隔较远的氨基酸侧链相互靠近。,长度缩短：球形、椭球形、杆状，等,多数同时含有,-,螺旋和,-,折叠,氨基酸位置由侧链极性决定：非极性（内）、极性（表面，少数内部）、带电（表面）,次级键维系：疏水键、盐键、氢键、范德华力、二硫键,功能区：表面或特定部位,寡聚蛋白中亚基的立体排布及相互作用。,亚基,(subunit),：寡聚蛋白中的单条独立的多肽链，具有独立的一、二、三级结构，单独存在时一般无生物学活性。亚基之间以非共价键联系，亚基可以相同或不同。,亚基之间以非共价键联系，包括疏水键（主要）、盐键、氢键、范德华力,亚基可以相同或不同,六、四级结构,七、蛋白质的分类,1,、按照组成分类：,单纯蛋白、结合蛋白,单纯蛋白：只有氨基酸组分,结合蛋白：氨基酸组分其他组分（辅基）,2,、按照生物功能分类：,酶、调节蛋白、转运蛋白、运动蛋白、防御蛋白、营养蛋白、储存蛋白、结构蛋白、毒蛋白，等,3,、根据形状分类,纤维蛋白,球状蛋白,第四节蛋白质结构与功能的关系,蛋白质一级结构是空间结构和生物功能的基础，一级结构决定空间结构；但一级结构并非决定空间结构的唯一因素。空间结构是生物活性的直接体现。,1,、一级结构中的保守序列决定空间结构,（,1,）不同蛋白质之间的比较：相似结构相似功能、不同结构不同功能,（,2,）同一蛋白质不同状态的比较：一级结构决定空间结构,【,经典举例,】,酶原激活、分子病、蛋白变性与复性,（,3,）保守序列、保守氨基酸改变，功能改变；保守氨基酸不变，功能不变,【,经典举例,】,分子病,一、一级结构与功能的关系,2,、一级结构并非影响空间结构的唯一因素,分子伴娘,(molecular chaperons,，分子伴侣,),：在蛋白质加工、折叠形成特定空间构象及穿膜进入细胞器的转位过程中起关键作用的一类蛋白质。,与未折叠的肽段（疏水部分）进行可逆的结合，辅助二硫键的正确形成；,引导肽链的正确折叠并集合多条肽链成为较大的结构；,可以解聚错误聚合的肽段，防止错误发生。,1,、空间结构体现生物特异性,2,、空间结构体现生物活性,3,、空间结构的灵活性，体现了生物活性的可调节特性,二、空间结构与功能的关系,空间结构中的特定区域体现生物活性,别构效应（别位效应、变位效应，,allosteric,effect,）：蛋白质分子的特定部位（调节部位）与小分子化合物（效应物）结合后，引起空间构象发生改变，从而促使生物学活性变化的现象称为变构效应。包括正协同、负协同效应,【,经典举例,】,血红蛋白（,Hb,）：由,2,2,四聚体组成，每个亚基含有,1,个血红素辅基；,Hb,的氧解离曲线呈“,S”,型。,多种空间构象，多种活性状态,4,、空间构象并非生物活性的唯一影响因素,【,举例,】,低温下酶活性低，但并不影响构象；盐析时沉淀的酶无活性，但构象不变。,5,、蛋白构象疾病：,错误构象相互聚集，形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病。,老年痴呆,疯牛病,亨汀顿舞蹈病,3,、分子病（,molecular disease,）：由于基因结构改变，蛋白质一级结构中的关键氨基酸发生改变，从而导致蛋白质功能障碍，出现相应的临床症状，这类遗传性疾病称为分子病。,【,经典举例,】,镰形细胞贫血症：编码珠蛋白,链的结构基因第六个密码子由,CTTCAT,，相应的多肽序列中,N,端的第六个氨基酸由,GluVla,；其空间结构发生相应改变，在表面形成互补区，使蛋白质分子之间彼此聚合，促使红细胞在低氧压下变形成镰形，丧失运输氧的生物活性。,第五节蛋白质的理化性质及分离纯化,1,、两性解离与等电点：同“氨基酸两性解离”,2,、紫外吸收：最大吸收波长,280nm,3,、胶体性质：不能透过半透膜,4,、沉淀、凝固,蛋白质在溶液中维持稳定的因素：,表面电荷、水化层（溶剂化层）,变性蛋白不一定沉淀，沉淀蛋白也不一定变性,一、理化性质,（,1,）变性：,在某些理化因素作用下，蛋白质的空间结构被破坏，从而导致其理化性质改变、生物活性丧失的现象称为变性。变性不涉及一级结构的变化。,理化性质的变化：紫外吸收、化学活性及粘度上升，易被蛋白酶水解；溶解度下降、结晶能力丧失。,5,、变性,(,denaturation,),、复性,(,renaturation,),（,2,）复性,（,3,）应用,利用变性：,酒精消毒,高压灭菌,血虑液制备,防止变性：低温保存生物制品,取代变性：乳品解毒,(,用于急救重金属中毒,),6,、呈色反应：双缩尿反应，等,双缩尿反应可检测蛋白质的水解程度,二、蛋白质的分离纯化,