实验三、叶绿素含量的测定等课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,实验三、叶绿素含量的测定等,*,实验三、,叶绿体色素含量的测定（分光光度法 和SPAD叶绿素仪法,）,高等植物在光合反应中吸收光能的主要色素为叶绿素 ,其含 有的叶绿素 a和叶绿素 b能将光能转化为化学能 ,形成有机物质。因此 ,叶片中叶绿素含量的高低是反映植物叶片光合能力的一个重要指标。,一、目的:,了解分光光度计和,SPAD叶绿素仪,的使用方法；理解分光光度计测定叶绿体色素含量的实验原理；掌握计算叶绿体各色素成分含量的方法。,实验三、叶绿素含量的测定等,要求：,2、问答题：,（1 ）Lambert-Beer定律又叫什么定律？列出其数学表达式（并说明各符号的代表意义）。 Lambert-Beer 定律中的比例系数“K ”的物理意义是 ？ Lambert-Beer 定律本身是否有局限性？何谓吸光度的加和性？,（2 ）叶绿素在兰光区的吸收峰高于红光区的吸收峰,为何不用兰光区的光吸收来测定叶绿素的含量？,（3）本实验为什么要用光路宽度为1cm的比色杯？,实验三、叶绿素含量的测定等,二、原理,叶绿素提取液中同时含有叶绿素a,和叶绿素b,二者的吸收光谱虽有不同,但又存在着明显的重叠,（如图）,在不,分离叶绿素a和叶绿素b的情况下同时测,定叶绿素a和叶绿素b的浓度,可分别测,定在665nm和649nm的光吸收,由于在,该波长时叶绿素a、b的比吸收系数K为,已知，我们即可以根据Lambert-Beer,定律,列出浓度C与光密度D之间的关系,式：,D,665,=83.31Ca+18.60Cb.(1),D,649,=24.54Ca+44.24Cb.(2),从而计算出提取液中叶绿素a和叶绿素b,的浓度.,叶绿素a、b的比吸收系数,波长(nm),叶绿素a,叶绿素b,665,83.31,18.60,649,24.54,44.24,注：,(1)(2)式中的D,665,、D,649,为叶绿素溶液在波长665nm和649nm时的光密度。叶绿素a、b的浓度单位为：g/L,实验三、叶绿素含量的测定等,解方程式(1)(2)，则得：,Ca=13.7 D,665,5.76D,649,(3),Cb=25.8 D,649,7.6 D,665,.(4),G,总,=Ca+Cb=6.10D,665,+20.04D,649,(5),注：,此时，Ca、Cb为叶绿素a、b浓度，单位为:mg/L，利用上面（3）（4）(5)式，即可以计算叶绿素a、b含量及总叶绿素的总含量(,G,总,),。,实验三、叶绿素含量的测定等,二、材料：,大红花老叶和嫩叶,三、实验步骤,1. 取新鲜大红花叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。,2. 称取剪碎的新鲜样品0.5g，放入研钵中，加少量碳酸钙和石英砂及23ml95乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，暗处静置35min。,3. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。,4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。,5. 把叶绿体色素提取液,稀释5倍,后倒入,光径1cm,的比色杯内。以95乙醇为参比，在波长665nm、649nm下测定光密度。,实验三、叶绿素含量的测定等,四、实验结果计算,将测定得到的吸光值代入下面的式子：,Ca=13.7 D,665,5.76D,649,(3),Cb=25.8 D,649,7.6 D,665,.(4),G,总,=Ca+Cb=6.10D,665,+20.04D,649,(5),分别计算叶绿素a、b和总叶绿素的含量,Chl（mg/g.FW）=,实验三、叶绿素含量的测定等,原理：,SPAD-502 叶绿素仪通过测量叶片在两种波长光学浓度差方式650nm 和940nm来确定叶片当前叶绿素的相对数量。,测量值是通过对在二个不同波长区域，叶片传输光的数量进行计算，在这二个区域叶绿素对光吸收不相同的。这二个区域是红光区(对光有较高的吸收且不受胡萝卜素影响)和红外线区(对光的吸收极低),开机,调零,测量1,测量2,测量3,求平均值,实验三、叶绿素含量的测定等,一 分光光度计的工作原理：,分光光度计采用一个可以产生,多个波长,的,光源,，通过系列分光装置，从而产生,特定波长,的,光源,，,光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。,样品的,吸光值,与,样品的浓度,成,正比,。,实验三、叶绿素含量的测定等,二 分光光度计的基本常识：,1、紫外光分光光度计，其使用,波长在190400nm,可见光分光光度计，其使用,波长在400800nm。,2,消光系数：,是溶液对光吸收的比例常数，指在一定的浓度和波长等条件下物质的光吸收值，用,K,表示。它取决于溶质性质、入射光波长和温度。,消光度,（也叫光密度OD，或吸光值A）：表示溶液吸收光的强弱或吸收程度，也用E表示。E值愈大，溶液对光吸收的程度愈大。,透光率（,用,T表示）,：,是透射光强度（透过比色皿）与入射射光强度（还未过比色皿之前的光强度）之比（用T =I,t,/I,0,表示）,。,实验三、叶绿素含量的测定等,三、 分光光度计的基本维护及使用注意事项：,1 分光光度计必须放置在固定且不受震动的仪器台上，不能随意搬动。严防震动、潮湿和强光直射。,2 分光光度计内放有硅胶干燥袋应定期更换。,3,仪器连续使用时间不应超过2小时，,每次使用需歇半小时以上才能再用。用完仪器后，务必关避电源开关，拔下插头。清理仪器上的杂物（包括灰尘、水啧、溶液等）。,4,千万不可用手、滤纸、毛刷等物摩擦,比色杯的光滑面,。,不允许用酒精、汽油、乙醚等有机溶液擦洗仪器。,5,盛待液时，必须达到比色杯的2/3左右，不宜过多。用完比色杯后应立即用自来水冲洗，再用蒸馏水洗净。,6 每套分光光度计上的比色杯及比色槽不得随意更换。,7,测定某未知待测液时，先制作该溶液的吸收光谱曲线，,再选择,最大峰的波长作为测定的波长,。一般所制成的溶液应,尽量使光密值在0.10.7的范围内,测定。,实验三、叶绿素含量的测定等,VIS-723N可见分光光度计,比色皿校正和多波长测定,操作步骤：,1.在主菜单下选择“2光度测量”,主菜单,1波长扫描,2光度测量,3定量分析,4时间扫描,5实时测量,6系统设置,3.比色皿配对完成后，按“RETURN”键退回光度测量参数设置界面。,4.按F2开始测量。可按照屏幕上的提示进行测量操作，当有多个样品需要测量时，可测完一个后再按“F2”测下一个。注意样品的编号N值必须和比色皿的编号一致。,2.按“F1”进行比色皿的校正，输入除参比杯外的比色杯个数后按“ENTER”键，再按“F2”，根据仪器提示进行操作即可。,实验三、叶绿素含量的测定等,AM-300手持式叶面积仪测定叶面积,原理：,内置固体标准光源的CCD扫描系,统,开机,按住电源开关1秒,选择显示方向,放入材料（不能直接接触探头）,按住探头上红色button,直至发出两种连续蜂鸣,屏幕提示“measure”可开始测量,探头从材料上方匀速滑过，等屏幕显示出完整叶片形状后再次按红色button结束测量,实验三、叶绿素含量的测定等,植物叶面积的测定（画纸称重法）,将所测叶片放在厚度均匀的称量纸上，用铅笔将叶形画好，剪下所画的纸叶，在电子天平上称重，记为W,1,；另取10*10cm,2,的纸片，称重记为W,2,；则所测叶片面积X可按下面公式计算出。,X（cm,2,）W,1,/W,2,100,实验三、叶绿素含量的测定等,CB-1102便携式光合蒸腾测定仪,实验三、叶绿素含量的测定等,特点：,非破坏性测量，即不离体测量,具有开路和闭路测量两种光合测量方式,可以手动或自动测量，可编程自动定时测量,全部测量参数和计算结果可以存贮，并通过 RS232接口传输到计算机,实验三、叶绿素含量的测定等,原理：,利用红外CO,2,分析器和湿度传感器对参考气和流经叶室后的测量气进行测量，根据CO,2,浓度差和湿度差以及流量等参数，利用气体通量公式，分别计算净光合（或呼吸）速率和蒸腾速率。,实验三、叶绿素含量的测定等,仪器中使用的参数：,a温度,CO,2,i室内CO,2,浓度,CO,2,o室外CO,2,浓度,RHi室内相对含水量,RHo室外相对含水量,PA光合有效辐照度,净光合速率,蒸腾速率,CO,2int,胞间CO,2,浓度,实验三、叶绿素含量的测定等,