6.实验六_RT-PCR(扩增)2

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验六,RT-PCR,-,扩增,分子生物学实验,一 实验目的,掌握扩增的基本原理和方法。,了解琼脂糖凝胶电泳对目的基因的检测方法,PCR,的原理类似于,DNA,的天然复制过程。即在模板,DNA,、寡核苷酸引物、四种脱氧核苷酸（,dNTP,）底物和,Mg2+,存在的条件下，由耐热的,TaqDNA,聚合酶催化,DNA,的复制，合成靶,DNA,。,PCR,包括三个基本过程：,（,1,）变性 加热模板使其离解成单链。,（,2,）退火 降低温度使人工合成的聚核苷酸引物与模板,DNA,种所要扩增的靶序列的两侧按碱基配对原则相结合。,（,3,）延伸 在适宜条件下，,Taq,DNA,聚合酶利用,dNTP,使引物,3,端向前延伸，合成与模板碱基完全互补的,DNA,链。,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（min）,温度,（）,PCR的基本原理,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复1,3步,25,30轮,目的DNA片段,扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链,与引物复性,DNA变性,形成2条单链,子链延伸,DNA加倍,MD-2,对,TLR4,的功能具有调控作用，是,TLR4,识别,LPS,，介导炎症反应过程中的重要辅助分子和调控分子,可以在配基识别、信号转导和表达分布几个水平调控,TLRs,的功能。,MD-2,可以影响,TLR4,在细胞内的分布，并促进,TLR2,和,TLR4,的表达。,MD-2,是分泌性蛋白质，由二硫键连接成稳定的二聚体或寡聚体、聚集体。有远距离广泛作用的可能性。,TLR4,是多种细胞内介导,LPS,信号的关键分子，,MD-2,与,TLR4,存在伴随表达关系，它提示细胞对,LPS,的反应性与,MD-2,和,TLR4,的表达水平密切相关。,MD-2,是天然免疫中的调控分子，其可以在验证、感染、免疫等病理生理过程当中具有极为广泛的生物学功能价值。,二 实验步聚,混样制备,cDNA,2uL 2,uL,2uL,X,（体积）,N(,样本数）,1.1,dNTP,2uL,2uL,2uL,DEPC,水,14.9uL 15.4uL 13.9uL,Mg2+ 1.5uL,1.5uL,2uL,10buffer 2.5uL,2.5uL,2.5uL,引物（目的,/,内参）,2uL 1.5uL 2.5uL,Taq,酶,0.1uL,0.1uL,0.1uL,94 5min 94 30s 62 30s 72 1min 72 10min 4 1h,32 Cycle,四 实验结果,反应结束后，向每管中加入,3uL,溴酚兰，混匀，取,18uL,进行琼脂糖凝胶电泳。,通过电泳鉴定,PCR,产物的纯度及大小是否正确。,通过相应的计算机软件对胶条进行灰度扫描，确定目的基因与参比基因的比值。,