实验十五、、表达载体的构建课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,实验十五、表达载体的构建,*,实验十二、表达载体的构建及鉴定,实验十五、表达载体的构建,基因工程中使用的表达系统类型,一、基因来源：,原核生物,真核生物,二、原核表达系统,1、原核表达系统：,遗传背景清楚，易改造，培养容易，费用,低，蛋白质表达水平高。但在原核中表达后所合,成的蛋白无自我修饰如糖基化等，或因折叠的方,式不正确或折叠效率的低下，最后产生的蛋白质,其生物活性很低。,2、真核表达系统,实验十五、表达载体的构建,原核表达载体,克隆载体,:,通常都带一个松复制子、一个多克隆位点和一个筛选标,记，以便被克隆和筛选的DNA序列能够大量增殖。,表达载体:,除了上述因子外，还需要有强启动子、核糖体结合位点(,核糖体结合位点,又称SD序列，它是指mRNA分子中核糖体结合的序列，通常位于翻译起始密码子前面312个碱基，该序列与16S rRNA的互补,),、转录起始信号、转录信号、翻译起始密码子(,ATG,)和终止密码子等一系列调控序列。,实验十五、表达载体的构建,原核表达系统类型,大肠杆菌,表达系统,遗传背景很清楚，基因操作的方法非常完善，很容易大规模培养产生大量的目的蛋白质。,但大肠杆菌表达的,蛋白质,大多不分泌到细胞体外，如要使,蛋白分泌到细胞外，,必需使目的基因带有,信号肽,。信号肽(,signal peptide,)又称前导肽(,1eader peptide,)，这是一种位于分泌蛋白质或输出蛋白质N端上长约1530个氨基酸的序列，可被细胞的蛋白质加工机制所识别，使蛋白质通过细胞膜被分泌出来。,枯草杆菌,表达系统,实验十五、表达载体的构建,实验十五、表达载体的构建,真核表达系统类型,酵母,表达系统,哺乳动物,细胞表达系统,昆虫杆状病毒,表达系统,植物细胞,表达系统。,真核表达系统类型需要有强启动子、增强子、连接序列（内含子）、转录起始信号、转录信号、多聚A信号、翻译起始密码子(,ATG,)和终止密码子等筛选标记等。,实验十五、表达载体的构建,大肠杆菌,表达系统,融合型原核表达载体,非融合型(天然蛋白质）原核表达载体,实验十五、表达载体的构建,pGEMEX-1载体图谱（融合型）,1. Gene10 reader peptide 260aa;,2. More than 50% cell peoteins, and 10mg/L of induced culture,实验十五、表达载体的构建,pET-5a载体图谱（非融合型）,实验十五、表达载体的构建,融合型原核表达载体,表达融合蛋白有下列优点,：,(1)转录和翻译起始从正常的,E. coli,序列开始，故通常可以产生高水平的融合蛋白。,(2)融合蛋白往往比天然的外源蛋白更加稳定。,(3)产生的融合蛋白较大，因此很容易从蛋白质凝胶电泳中区别出来。融合蛋白带可以从凝胶上切下，经冷冻干燥，磨成粉末后即可作为抗原。,(4)有些融合蛋白带有信号肽，可以分泌到细胞外，这有助于蛋白质的分离和纯化。,实验十五、表达载体的构建,非融合型(天然蛋白质）原核表达载体,通常天然蛋白表达载体（非融合型表达载体）都含有一个强的可调控的启动子和一个有效的核糖体结合位点。,大多数原核基因中都带有一个有效的核糖体结合位点，对这些带有强核糖体结合位点的原核基因，只须提供一个启动子；,而对被表达的真核基因(或带有弱核糖体结合位点的原陔基因)，就必须同时提供一个强启动子和一个有效的核糖体结合位点。,实验十五、表达载体的构建,选择表达载体应考虑的因素,(1). 所表达的蛋白质是融合蛋白还是天然蛋白。如果是天然,蛋白，必须考虑如何将目的准确地与载体衔接。如果是融合蛋白，,载体是由一系列3种不同阅读框架的载体组成，当用同一种限制酶切割载体并与目的DNA片段重组时，则可以保证其中至少有一种融合蛋白的框架与之吻合.,(2). 被表达的基因是原核基因还是真核基因。原核基因一般都带有核糖体结合位点，只虑它是否带有强启动子。对真核基因除考虑该基因是否带有启动子、核糖体结合位点外，考虑该基因是否会产生翻译后加工，以后是否需要转到真核表达系统中表达等。,(3). 表达蛋白是否分泌到体外。如需要分泌，则必须带有信号肽序列，故应选择带适当,序列的载体。,实验十五、表达载体的构建,选择表达载体应考虑的因素,(4).所产生的融合蛋白是否需要切割加工以及如何切割,加工。对需要切割的融合蛋白，在目的基因和载体,序列间应有适当的切割识别序列。,(5).是否需要用强启动子提高表达水平。当需要提高表,达水平时，可选用强启动子。但在某些情况下，由,于被表达蛋白质对宿主有毒或其大量表达对宿主不,利，可选用诱导型载体，只有经诱导后，蛋白质才,能被表达。,实验十五、表达载体的构建,三种不同阅读框架图例,实验十五、表达载体的构建,PinPoint Xa-1 图谱,实验十五、表达载体的构建,实验十五、表达载体的构建,目的基因的表达产物检测,A,重组载体的构建：,将目的DNA片段与表达载体连接，产生阅读框架对应的融合.,B,转化,：将重组后pGEMEX-1载体转化,E.coli,JMl09，然后涂布于含氨苄青霉素 (100,g/m1)的LB平板上，在37下培养过夜。筛选能在平板上生长的转化子。,C,转化子鉴定:,将转化子挑出后，小批量培养，抽提质粒进行酶切鉴定或者PCR鉴定，确证克隆片段确为所需目的片段后，进行诱导表达。,D,诱导表达：,将含有重组质粒的JM109接入5ml含100ug/m1 Amp的LB培养基中培养过夜，第二天取50ul培养液接种到另一5ml LB(内含100ug/m1Amp)培养基的试管中培养至光密度值OD,600,为0.5左右，加入IPTG终浓度至lmmol/L，继续培养6-12小时，使基因表达。,表达产物的检测,：诱导表达后的细胞经5000g离心后，TE缓冲液悬浮后加入SDS-PAGE上样缓冲液电泳检查或进行Western blot检测。,实验十五、表达载体的构建,目的基因的表达产物检测,重组载体的构建：,将目的,DNA,片段与表达载体连接，产生阅读框架对应的 融合,.,转化,：将重组后,pKK233-2,载体转化,E.,coli,JMl09,，,然后涂布于含氨苄青霉素,(100,g/m1),的,LB,平板上，在,37,下培养过夜。筛选能在平板上生长的转化子。,转化子鉴定,:,将转化子挑出后，小批量培养，抽提质粒进行酶切鉴定或者,PCR,鉴定，确证克隆片段确为所需目的片段后，进行诱导表达。,诱导表达：,A.,将含有重组质粒的,JM109,接入,5,ml,含,100,ug,/m1 Amp,的,LB,培养基中培养过夜,.,B.,第二天取,50,ul,培养液接种到另一,5,ml LB(,内含,100,ug,/m1Amp),培养基的试,管中培养至光密度值,OD,600,为,0.5,左右，加入,IPTG,终浓度至,lmmol,/L.,C.,继续培养,6-12,小时，使基因表达。,5.,表达产物的检测,：,A.,取,1.0,ml,诱导表达后的培养液,经,10000,rpm,离心,3,min,去上清液。,B.,细胞沉淀用,100,ul,1X SDS-PAGE,上样缓冲液悬浮。,C.,沸水浴处理,3-5,min.,D.,10000,rpm,离心,3,min,取上清液进行,SDS-PAGE,和,Western blot,检测。,实验十五、表达载体的构建,