质粒DNA限制性酶切图谱分析

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,一、,DNA,的限制性酶切实验原理,实验三,质粒,DNA,限制性酶切图谱分析,核酸限制性内切酶是一类能识别双链中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统， 用于抗击外来的侵袭。,限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键， 产生的片段,端为，,端为。,根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为,、,型三大类。,第一类（,I,型）限制性内切酶,能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割,DNA,链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在,DNA,重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析,DNA,结构或克隆基因。这类酶如,Eco,B,、,Eco,K,等。,1. 限制性内切酶的类型,一、,DNA,的限制性酶切实验原理,第三类（,III,型）限制性内切酶,也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度,DNA,片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。,1. 限制性内切酶的类型,一、,DNA,的限制性酶切实验原理,第三类（,型）限制性内切酶,就是通常指的限制性内切酶,.,它们能识别双链的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的片段；,型酶分子量较小，仅需,Mg2+,作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为个碱基对的反转重复顺序；,型内切酶切割双链产生种不同的切口,端突出；,端突出和平末端。,正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能在体外有目的地对遗传物质进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。,1. 限制性内切酶的类型,一、,DNA,的限制性酶切实验原理,粘性末端,：,是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。,如,Eco,RI,的识别顺序为：,5,G,|,AATTC 3,3 CTTAA,|,G 5,在双链上交错切割的位置切割后生成,5,G AATTC3,3CTTAA G5,各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过,DNA,连接酶的作用而“粘合”。,II,型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如,Eco,RV,的识别位置是：,5,GAT,|,ATC 3,3 CTA,|,TAG 5,切割后形成,5,GAT ATC 3,3 CTA TAG 5,这种末端同样可以通过,DNA,连接酶连接起来。,平头末端：,用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如,E. coli,用,Eco,表示，所以用斜体字。,用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌(,Heamophilus influenzae,)Rd,菌株用,d，,即,Hin,d。,如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰酶，则以罗马数字表示，如,Hin,d,Hin,d，,Hin,d,等。,2. 限制性核酸内切酶的命名法,一、,DNA,的限制性酶切实验原理,由,pUC18,改造而来，大小为 3162,bp,。,相当于在,pUC18,中增加了带有,M13,噬菌体,DNA,合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。,琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于,琼脂糖的浓度,。,DNA,分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。,DNA,分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同,DNA,的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而,分出不同的区带,。,二、琼脂糖凝胶电泳实验原理,琼脂糖凝胶电泳法分离,DNA，,主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据,DNA,分子的大小使其分离。该过程可以通过把,分子量标准参照物,和样品一起进行电泳而得到检测。,溴化乙锭（,EB）,为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。,EB,可与,DNA,分子形成,EB-DNA,复合物，其荧光强度与,DNA,的含量成正比。据此可粗略估计样品,DNA,浓度。,二、琼脂糖凝胶电泳实验原理,（1）琼脂糖含液体量大，可达98-99%，近似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小。,（2）电泳速度快。,（3）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定。,（4）样品易回收，常用于制备。,琼脂糖电泳的优点,配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的,DNA,分子大小来确定。,琼脂糖凝胶浓度与线性,DNA,分辨范围,常用的电泳缓冲液,4 保存备用.,常用的6,X,载样缓冲液, 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液, 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液,三 材料、设备及试剂,质粒,：,pUC118、,pEGFP,设备,：,eppendorf,管、微量取液器，台式高速离心机，电泳仪、电泳槽、,UVP,凝胶成像系统、微波炉,试剂：,琼脂糖 、,TAE,电极缓冲液、,Lamdar,DNA,EcoR,I/,Hind,、 EB、加样缓冲液,四、操作步骤,1、质粒,DNA,的限制性酶切反应,（1）、将清洁干燥并经灭菌的,eppendorf,管编号,用微量移液枪分别加入,DNA 5l， 10,缓冲液2,l,BSA 2ul，EcoRI 1ul，ddH2O 10ul，,用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底,。此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。 （2）、混匀反应体系后,将,eppendorf,管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37水浴保温1小时,使酶切反应完全。 （3）、每管加入2,l 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。,2、琼脂糖凝胶电泳,(1)称取0.25,g,琼脂糖，置25,ml,电泳缓冲液中，加热使琼脂糖溶解；,(2),待溶液冷至60,，加入2,ul,SYBR Green I。,(3),在距离胶模底板0.5-1,mm,处放置电泳梳，将琼脂糖溶液倒入胶模中，厚度约3-5,mm，,注意避免产生气泡；,(4),凝胶完全凝固后，,移去梳子和挡板,，将凝胶放入电泳槽。加入,TAE,缓冲液使恰好没过胶面约1,mm；,(5),将,DNA,样品,与1/6体积加样缓冲液混合后，加入样品槽中；,(6),接通电源，使样品槽在负极端，用,80,V,的电压，至溴酚蓝到胶前沿时，停止电泳。,(7)凝胶自动处理系统（,UVP）,观察和拍照，记录结果。,样品,：,DNA5ul、6X,点样液2,ul,，,电极缓冲液5,ul,pUC118、,pEGFP,、 pUC118/ EcoRI 、,pEGFP,/ EcoRI 、,细菌基因组,DNA,DNA Marker,(,2,ul,，,6X,点样液2,ul,，,电极缓冲液5,ul,),内切酶：,不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染；注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；,内切酶的用量：根据内切酶单位和用量而定，通常 1,u,指在适当条件下，1小时内完全酶解,ug,特定底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以,ug,DNA,对,u,酶短时间为宜。,同时内切酶体积不能超过反应体系，因内切酶中含甘油，体系中甘油超过会抑制内切酶活力；,内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。,五、注意事项限制性内切酶酶切,作为内切酶底物，应该具备一定的纯度，其溶液中不,能含酚、氯仿、乙醚、,SDS、EDTA、,高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。,这种抑制可通过：,增加酶作用单位数（1020,U/,ug,DNA）、,增大反应体积以稀释可能的抑制剂,或延长反应时间加以克服。,五、注意事项限制性内切酶酶切,：,反应缓冲液主要由,Tris,HCl,、,NaCl,、Mg2,+,组成，其中,Mg2,+,为内切酶辅基；,Tris,HCl,维持反应体系,pH,值在7.2-7.6之间；,NaCl,浓度不同形成种级别的离子强度：,低盐（10,mM NaCl,),中盐（50,mM NaCl,）,高盐（100,mM NaCl,）,不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。,五、注意事项限制性内切酶酶切,反应缓冲液：,大多数限制酶反应温度为，如,EcoR, Hind,BamH,Pst,等，也有如,Bcl,需在下进行反应，,反应时间根据酶的单位与用量之比来定，原则是酶：=：,五、注意事项限制性内切酶酶切,酶解温度与时间：,小时即可，充分酶解。,五、注意事项,DNA,凝胶电泳,1.琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响,DNA,的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。,2.凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。,3.电泳缓冲液：为保持电泳所需的离子强度和,pH，,应常更新电泳缓冲液。,4. 样品加入量：一般情况下，0.5,cm,宽的梳子可加0.5,g,的,DNA,量，加样量的多少依据加样孔的大小及,DNA,中片段的数量和大小而定。当加样孔大时，样品上样量应相应加大，否则会造成条带浅甚至辩认不清；,反之则应适当减少加样量，但是上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的,DNA,此现象更明显。,5.,DNA,样品中,盐浓度,会影响,DNA,的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。,DNA,迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的,DNA,分子，制备琼脂糖凝胶可根据,DNA,分子的范围来决定凝胶的浓度。,小片段的,DNA,电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。,五、注意事项,DNA,凝胶电泳,内切酶失活,DNA,不纯，含有,SDS，,酚，,EDTA,等内切酶抑制因子,条件不适（试剂、温度）,DNA,酶切位点上的碱基被甲基化,DNA,酶切位点上没有甲基化（如,Dpn,I）,DNA,位点上存在其它修饰,DNA,不存在该酶识别顺序,标准底物检测酶活性,将,DNA,过柱纯化，乙醇沉淀,DNA,检查反应系统是否最佳,换用对,DNA,甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒,DNA,转化至,dcm,-，dam-,基因型的细菌菌株,换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化,DNA（,如,San3A I,代替,Dpn,I)，,重新将质粒转至,dcm,+ dam+,菌株中扩增,将,DNA,底物与,DAN,混匀进行切割验证,换用其它的酶切割,DNA,或过量酶消化进行验证,六、,限制性内切酶酶切,常见问题分析,问题一：,DNA,完全没有被内切酶切割,原,因,对,策,内切酶活性下降,内切酶稀释不正确,DNA,不纯，反应条件不佳,内切酶识别的,DNA,位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰,部分,DNA,溶液粘在管壁上,内切酶溶液粘度大，取样不准,酶切后,DNA,粘末端退火,由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性,过度稀释使酶活性降低,反应条件不适,识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序,用5-10倍量过量消化,用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶,同上,同上,反应前离心数秒,将内切酶稀释，增大取样体积,电泳前将样品置65保温5-10分钟，取出后置冰浴骤冷,使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡,适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏,使用最佳反应体系,加大酶量5-10倍,问题二：,DNA,切割不完全,原因,对,策,六、,限制性内切酶酶切,常见问题分析,内切酶星状活性,其它内切酶污染,底物中含其它,DNA,杂质,检查反应条件：甘油浓度大于12%，盐度过低，,Mn2+,的存在及酶：,DNA,值过大均均可导致星状活性，降低酶的用量,用,DNA,作底物检查酶切结果,电泳检查,DNA，,换用其它酶切，纯化,DNA,片段,问题三：,DNA,片段数目多于理论值,原因,对,策,六、,限制性内切酶酶切,常见问题分析,DNA,定量错误（如,RNA,含量较高）,在酶切反应液中形成非特异的沉淀,用,RNA,酶,A（,无,DNA,酶）100,ug,/ml,消化,DNA,样，酚抽提后沉淀溶解，定量,在反应前透析,DNA,样品或用酒精沉淀二次,问题四：酶切后没有观察到,DNA,片段的存在,原因,对,策,五、,限制性内切酶酶切,常见问题分析,保存温度不合适,以稀释形式保存,贮藏缓冲液不适当,低蛋白浓度,内切酶贮藏在含50%甘油的贮藏液中，应在-20低温保存,稀释酶液不宜长期存放，应一次使用,使用厂家推荐的贮藏缓冲液,内切酶与500,ug,/ml,的,BSA,一起保存,问题五：内切酶保存期内快速失活,原因,对,策,五、,限制性内切酶酶切,常见问题分析,DNA,上结合有蛋白质,内切酶中含有,DNA,外切酶,减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶,减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶,问题六：电泳后,DNA,片段的带型弥散，不均一,原因,对,策,五、,限制性内切酶酶切,常见问题分析,含磷酸盐的浓度高,内切酶失活不全或含有,ATP,酶,平末端连接,外切酶污染,连接缓冲液不合适,透析，乙醇沉淀去除磷酸盐,延长灭活时间或用酚抽提，乙醇沉淀回收,DNA,加大,T4 DNA,Ligase,用量,减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收,DNA,重新配制连接缓冲液,七、,DNA,电泳常见问题分析,问题七,：,酶切后的,DNA,片段连接效率低,原因,对,策,DNA,降解,电泳缓冲液陈旧,所用电泳条件不合适,DNA,上样量过多,DNA,样含盐过高,有蛋白污染,DNA,变性,避免核酸酶污染,电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，,pH,值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液,电泳时电压不应超过20,V/cm，,温度30；巨大,DNA,链电泳，温度应15；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力,减少凝胶中,DNA,上样量,电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐,电泳前酚抽提去除蛋白,电泳前勿加热，用20,mM NaCl,缓冲液稀释,DNA,七、,DNA,电泳常见问题分析,问题一：,DNA,带模糊,原因,对,策,对于,/,Hin,d III,片段,cos,位点复性,电泳条件不合适,DNA,变性,电泳前于65加热,DNA 5,分钟，然后在冰上冷却5分钟,电泳电压不超过20,V/cm；,温度30；经常更换电泳缓冲液,以20,mM NaCl,Buffer,稀释,DNA，,电泳前勿加热,问题二：,不规则,DNA,带迁移,对,策,原因,七、,DNA,电泳常见问题分析,DNA,的上样量不够,DNA,降解,DNA,走出凝胶,对于,EB,染色的,DNA，,所用光源不合适,增加,DNA,的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低,避免,DNA,的核酸酶污染,缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度,应用短波长（254,nm）,的紫外光源,问题三：,带弱或无,DNA,带,对,策,原因,七、,DNA,电泳常见问题分析,小,DNA,带走出凝胶,分子大小相近的,DNA,带不易分辨,DNA,变性,DNA,链巨大，常规凝胶电泳不合适,缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度,增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度,电泳前请勿高温加热,DNA,链，以20,mM NaCl,Buffer,稀释,DNA,在脉冲凝胶电泳上分析,问题四：,DNA,带缺失,对,策,原因,七、,DNA,电泳常见问题分析,八、问题与讨论,1. 在整个酶切反应过程中应注意哪些问题？,2. 反应体系中为何内切酶用量不能超过整个反应体系的10？,3. 在酶切缓冲液中加入牛血清白蛋白（,BSA,）,的目的与机理是什么？,Lambda DNA/,EcoRI,+,HindIII,Marker,