质粒DNA的分离`纯化

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,质粒是染色体外的,DNA,分子，大小可为,1kb,到,200kb,。,大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。,其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。,一、实验原理,实验二 质粒,DNA,的分离、纯化,可再生资源利用与加工实验教学中心,质粒,DNA,煮沸法,煮沸法原理,染色体,DNA,比质粒,DNA,分子大得多，且染色体,DNA,为线状分子，而质粒,DNA,为共价闭合环状分子；,当加热处理,DNA,溶液时，线状染色体,DNA,容易发生变性，共价闭环的质粒,DNA,在冷却时即恢复其天然构象；,变性染色体,DNA,片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒,DNA,分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,质粒,DNA,碱裂解法,碱裂解法原理,当用碱处理,DNA,溶液时，线状染色体,DNA,容易发生变性，共价闭环的质粒,DNA,在回到中性,pH,时即恢复其天然构象；,SDS,是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以,SDS,处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒,DNA,以及基因组,DNA,从细胞中同时释放出来。释放出来的,DNA,遇到强碱性（,NaOH,）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒,DNA,将迅速复性，而基因组,DNA,，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒,DNA,将在上清中，而基因组,DNA,则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒,DNA,从细菌中提取出来。,碱裂解法流程图,对数期菌体,溶液,III,中和,溶液,I,充分重悬,溶液,II,裂解,上清液,抽提,离心洗涤,酒精沉淀,干燥溶解,沉淀,质粒,DNA,溶液,菌种,：,E. coli MV1184,（含,pUC118,）、,E. coli K12,（含,pEGFP,）,设备,：,eppendorf,管、微量取液器,(20l,200l,1000l),， 台式高速离心机， 涡旋振荡器,试剂,：,LB,液体培养基 、溶液,、溶液,、溶液,、,RNA,酶,A,、饱和酚,:,氯仿,1:1,二、材料、设备及试剂,溶液,：,50mM,葡萄糖；,25mM Tris,HCl,（,pH8.0,）；,10mM EDTA,溶液,：,（新鲜配制）,0.2N NaOH,；,1% SDS,溶液,：,5M KAC 10ml,；冰醋酸,11.5ml,；水,28.5ml,1,、,取,1.5ml,培养液倒入,1.5ml eppendorf,管中,4,下,12000g,离心,30,秒。,2,、,弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。,3,、,菌体沉淀重悬浮于,100l,溶液,中,(,需,剧烈振荡,),室温下放置,5-10,分钟。,4,、,加入新配制的溶液,200l,盖紧管口，,快速温和颠倒,eppendorf,管数次,以混匀内容物,(,千万不要振荡,),冰浴,5,分钟。,5,、,加入,150l,预冷的溶液,盖紧管口，并倒置离心管，,温和振荡,10,秒,使沉淀混匀,冰浴中,5-10,分钟,4,下,12000g,离心,5-10,分钟。,6,、,上清液移入干净,eppendorf,管中,加入等体积的酚,/,氯仿,(1:1),振荡混匀,4,下,12000g,离心,5,分钟。,7,、,将水相移入干净,eppendorf,管,中,加入,2,倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于,-20,冰箱中,20,分钟，然后,4,下,12000g,离心,10,分钟。,8,、,弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入,1ml 70,乙醇洗沉淀一次,4,下,12000g,离心,5-10,分钟。,9,、,吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥,10,分钟或室温干燥。,10,、,将沉淀溶于,20l TE,缓冲液,(pH8.0,，含,20g /ml RNaseA),中，储于,-20,冰箱中。,三、操作步骤,实验结果,：,获得质粒,DNA,（,pUC118,及,pEGFP,）,四、注意事项,材料准备,使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）,培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失,尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量,菌株不要频繁转接（质粒丢失）,四、注意事项,细胞裂解,菌体量适当。,培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。,变性的时间不要过长（,5,分钟），否则质粒易被打断。,复性时间也不宜过长，否则会有基因组,DNA,的污染。,G,菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁。,四、注意事项,核酸分离、纯化,采用吸附材料吸附的方式分离,DNA,时，应提供相应的缓冲体系,采用有机（酚,/,氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔,离心分离两相时，应保证一定的转速和时间,针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,四、注意事项,核酸沉淀、溶解,当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分,沉淀时加入,1/10,体积的,NaAc,（,pH5.2,，,3M,），有利于充分沉淀,沉淀后应用,70,的乙醇洗涤，以除去盐离子等,晾干,DNA,，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）,若长期储存建议使用,TE,缓冲液溶解,TE,中的,EDTA,能螯和,Mg,2+,或,Mn,2+,离子，抑制,DNase,pH,值为,8.0,，可防止,DNA,发生酸解,菌体老化,碱裂解不充分,菌体中无质粒,溶液使用不当,请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养,可减少菌体用量或增加溶液的用量,不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。检查抗生素使用浓度是否正确。,溶液,在温度较低时可能出现浑浊，置于,37,保温片刻直至溶解为清亮的溶液,。,五、质粒,DNA,提取常见问题,问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？,原因,对,策,混有蛋白,混有,RNA,混有基因组,DNA,不要使用过多菌体。重新纯化,DNA,，去除蛋白、多糖、多酚等杂质,加入,RNaseA,室温放置一段时间,加入溶液,II,和,III,后,防止剧烈振荡，可能把基因组,DNA,剪切成碎片从而混杂在质粒中。细菌培养时间过长会导致细胞和,DNA,的降解，培养时间不要超过,16,小时。,五、质粒,DNA,提取常见问题,问题二：质粒纯度不高，如何解决？,原因,对,策,1.,简要叙述溶液,、溶液,和溶液,的作用，以及实验中 分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因。,2.,染色体,DNA,与质粒,DNA,分离的主要依据是什么？,六、问题与讨论,