第三章核酸化学

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章,核,酸化学,(Nucleic Acid Chemistry),第一节,核酸的重要性,(,Importantance,of Nucleic Acids),What are nucleic acids?,Nucleic acids are a kind of very important,biomacromolecule,.,They exist in all organism (including virus).,They play very important role during organism living activate such as:,growth,development,reproducing,heredity,variation.,So it can also say that there is no life without nucleic Acids.,核酸化学研究史：,（,1,）,1869,年,Miescher,博士论文工作中测定淋巴细胞蛋白质组成时,发现了不溶于稀酸和盐溶液的沉淀物,并在所有细胞的核里都找到了此物质,故命名,“,核质,(,Nuclein,),”,即今天我们所说的脱氧核糖核蛋白，其中脱氧核糖核酸的含量为,30%,。,（,2,）,1889,年,Altman,等人又从酵母和动物的细胞核中得到了不含蛋白质的核酸，并建议将,“,核质,”,改名为,“,核酸,”,因为已经认识到,“,核质,”,乃,“,核酸,”,与蛋白质的复合体。,（,3,）,1944,年,O.T.Avery,等人通过细菌转化实验证明核酸是遗传物质。,目前，核酸的的研究已成为生物学研究中最活跃的一个领域，是最重要的生物大分子。,第二节 核酸的分类及其在细胞内的分布,（,Classification and distribution,of,nucleic acid,）,一、核酸的分类,Nucleic acids are grouped into two types nucleic acid,：,（一） 脱氧核糖核酸,（,deoxyribonucleic acid , DNA),（二） 核糖核酸（,ribonucleic acid ,RNA),1,、转移,RNA,（,transfer RNA ,tRNA,),2,、核糖体,RNA,（,ribosomal RNA ,rRNA,),3,、信使,RNA,（,mesenger,RNA , mRNA),4,、特殊功能的,RNA:,Small nuclear RNA ,snRNA,Small,nucleoar,RNA ,snoRNA,Small,cytoplasmic,RNA ,scRNA,Antisense,RNA,Ribozyme,RNase,P,二、核酸的分布,In eukaryotes,，,DNA mainly exist in nucleus,（,more than 98%,）；,mitochondria and chloroplasts respectively have their own DNA.,In prokaryotes,，,DNA exist in,nucleoid,（拟核区）,.,Every prokaryotic cell only contain one,chromsome,（染色质），,which is double-strand circular DNA molecule.,In addition,，,It also contain plasmid DNA,（质粒,DNA,）,Viruses,consit,nucleic acid,（,DNA or RNA,）,coated with protein,（,called,capsid,，病毒衣壳）,.,RNA mainly exist in the,cytosol,（,90%,），,the other 10% in nucleus.,三、核酸的功能,（一）,DNA,是主要的遗传物质,1944,，,O. Avery,肺炎双球菌转化实验,1952,，,A.D Hershey,和,M. Chase,噬菌体感染实验,（,二）,RNA,功能的多样性,1,、参与蛋白质的合成,2,、,RNA,的转录后加工与修饰,3,、参与基因表达的调控,4,、生物催化作用,第三节 核酸的结构,核 酸（,nucleic acid),核苷酸,(nucleotide),磷酸,(phosphoric acid),核苷,(nucleoside),戊糖,(pentose),碱基,(base),一、核酸的化学组成,两类核酸的基本化学组成,RNA,：,D-,核糖，,A,、,G,、,C,、,U,碱基,DNA,：,D-2-,脱氧核糖，,A,、,G,、,C,、,T,碱基,（一）,碱基,1.,嘧啶碱：尿嘧啶 胞嘧啶 胸腺嘧啶,2.,嘌呤碱： 腺嘌呤 鸟嘌呤,嘌呤衍生物 ：,3.,核酸中的修饰碱基：,100,余种，多数是甲基化的产物,Structure of T and C,Structure of A and G,（二）,核苷与脱氧核苷,嘧啶碱：,C,1,N,1,，,嘌呤碱：,C,1,N,9,。,核酸中的核苷与脱氧核苷均为,-,型,碱基平面与核糖平面互相垂直,2,、核酸中的稀有核苷,稀有碱基,稀有糖苷键：假尿嘧啶核苷（,）,P481,甲基化核糖,（三）,核苷酸,核苷中戊糖,C,2,、,C,3,、,C,5,羟基被磷酸酯化,1. Bases, Nucleosides, and Nucleotides,Cytosine,Cytidine,Cytidine,monophosphate,CMP,Uracil,Uridine,Uridine,monophosphate,UMP,Thymine,Thymidine,Thymidine,monophosphate,AMP,Adenine, Adenosine, Adenosine,monophosphate,AMP,Guanine,Guanosine,Guanosine,monophosphate,GMP,2,、,细胞内的游离核苷酸及其衍生物,核苷,5-,多磷酸化合物,ATP,、,GTP,、,CTP,、在能量代谢和物质代谢及调控中起重要作用。,环核苷酸,3,5-cAMP,，,3,5-cGMP,信号分子，,cAMP,调节细胞的糖代谢、脂代谢。,二、,DNA,的结构,一级结构：脱氧核苷酸分子间连接方式及排列顺序。,二级结构：,DNA,的两条多聚核苷酸链间通过氢 键形成的双螺旋结构。,三级结构：,DNA,双链进一步折叠卷曲形成的构象。,（一）,DNA,的一级结构,蛇毒磷酸二酯酶水解,DNA,（,RNA,）得,5-,核苷酸,牛脾磷酸二酯酶水解,DNA,（,RNA,）,得,3-,核苷酸,P482,图,13-1,磷酸二酯酶对核酸的水解作用,DNA,是,dAMP,、,dGMP,、,dCMP,、,dTMP,通过,3,、,5-,磷酸二酯键连接起来的线形或环形多聚体。,P483,图,13-2DNA,中多核苷酸的一个片段及缩写符号,写法：,53,：,5-pApCpTpG-3,，,或,5ACTG3,（二）,DNA,的二级结构,1953,年，,Watson,和,Crick,根据,Chargaff,规律和,DNA Na,盐纤维的,X,光衍射分析提出了,DNA,的双螺旋结构模型。,Photo by A.C. Barrington Brown, courtesy of Cold Spring Harbor Laboratory Archives.,1962 Francis Crick, James Watson, and Maurice Wilkins receive the Nobel Prize for,determining the molecular structure of DNA.,Chargaff,规律,1950,年,所有生物的,DNA,中，,A=T,，,G=C,且,A+G=C+T,。,b. DNA,的碱基组成具有种的特异性。,c. DNA,碱基组成没有组织和器官的特异性。,d.,年龄、营养状况、环境等因素不影响,DNA,的碱基组成。,Structure of DNA Double Helix,1,、,Watson-Crick,双螺旋结构模型,(B-DNA),（,1,）,DNA,分子为两条多核苷酸链以相同的螺旋轴为中心，盘绕成右旋、反向平行的双螺旋,.,（,2,）磷酸和戊糖组成的骨架位于螺旋外侧，碱基 位于螺旋内侧，并且按照碱基互补的原则，碱基之间通过氢键形成碱基对，,A-T,间形成二个氢键、,G-C,间形成三个氢键,.,（,3,）双螺旋的直径是,2nm,，每,10,个碱基对旋转一周，螺距为,3.4nm,，所有的碱基平面都与中心轴垂直,.,（,4,）维持双螺旋的力是碱基堆积力和氢键,.,3.4nm,（,1.2nm,0.85 nm,）,（0.6nm,0.75 nm,）,Double helix,Right-handed,10 base pairs/turn,3.4 nm,/turn,Diameter: ca. 2.0 nm, 磷酸与脱氧核糖彼此通过,3,、,5-,磷酸二酯键相连接，构成,DNA,分子的骨架。,磷酸与脱氧核糖在双螺旋外侧，嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋的内侧。,碱基平面与纵轴垂直，糖环平面与纵轴平行, 两条核苷酸链之间依靠碱基间的氢链结合在一起。,螺圈之间主要靠碱基平面间的堆积力维持, 每圈螺旋,10.4nt,，,碱基堆积距,0.34nm,，,双螺旋平均直径,2nm,，,大沟：宽,1.2nm,，,深,0.85nm,，,小沟 ：宽,0.6nm,，,深,0.75nm,2,、稳定双螺旋结构的因素,碱基堆积力形成疏水环境（主要因素） 。,碱基配对的氢键。,GC,含量越多，越稳定。,磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白的正离子之间形成离子键，中和了磷酸基上的负电荷间的斥力，有助于,DNA,稳定。,碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，可免受水溶性活性小分子的攻击。,3,、,DNA,二级结构的多型性,P489,表,13-6 A-,、,B-,、,Z-DNA,的比较,相对湿度,92%,：,BDNA,相对湿度,75%,：,ADNA,。,（,1,）,BDNA,：,典型的,Watson-Crick,双螺旋,DNA,右手双螺旋,每圈螺旋,10.4,个碱基对,螺距：,3.32nm,（,2,）,A-DNA,右手双螺旋，外形粗短。,RNA-RNA,、,RNA-DNA,杂交分子具有这种结构。,（,3,）,Z-DNA,左手螺旋，外形细长。,天然,B-DNA,的局部区域可以形成,Z-DNA,。,（,4,）三股螺旋,DNA,K.,Hoogsteen,1963,通常是一条同型寡核苷酸与寡嘧啶核苷酸,-,寡嘌呤核苷酸双螺旋的大沟结合：,oligo(Py,),:,oligo(Pu,),oligo(Py/Pu,),第一股是寡嘧啶，中间是寡嘌呤，第三股可以是寡嘧啶或寡嘌呤,T= A : A , CG ： C,+,T = A : T CG ： G,第三股与寡嘌呤之间同向平行，并按,Hoogsteen,配对,DNA,三股螺旋结构常出现在,DNA,复制、转录、重组的起始位点或调节位点，如启动子区。,第三股链的存在可能使一些调控蛋白或,RNA,聚合酶等难以与该区段结合，从而阻遏有关遗传信息的表达。,(,三）,DNA,的三级结构,DNA,在双螺旋的基础上通过扭曲和折叠形成的构象,超螺旋是,DNA,三级结构的主要形式,1,、 环状,DNA,的三种典型构象,P491,图,13-12,（,1,）、,松弛环形,DNA,线形,DNA,直接环化,（,2,）、,解链环形,DNA,线形,DNA,拧松后再环化,（,3,）、,正超螺旋与负超螺旋,DNA,2,、 三种环形,DNA,的拓扑学特性,连环数（,linking number , L,）,DNA,双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数,扭转数（,twisting number , T,）,DNA,分子中的,Watson-Crick,螺旋数目，以,T,表示,超螺旋数（缠绕数, writhing number , W,）,连环数（,L,）,缠绕数（,T,）,扭曲数,W,松驰环,25,25,0,解链环,23,23,0,超螺旋,23,25,-2,L=T+W,负超螺旋,DNA,是由于两条链的缠绕不足引起（,L,），,很易解链，易于参加,DNA,的复制、重组和转录等,3,、真核生物染色体的结构,染色质、染色体,常染色质、异染色质,永久性异染色质、功能性异染色质,核小体（,nucleosome):146bp,组蛋白：,H2A,、,H2B,、,H3,、,H4,P495,图,13-17,真核生物染色体,DNA,的,组装层次,MOV：MCB4.0three dimensional packing of nuclear chromosomes,三、,RNA,的结构,（一）,RNA,的一级结构,P483,AMP,、,GMP,、,CMP,、,UMP,通过,3,、,5,磷酸二酯键形成的线形多聚体。, 组成,RNA,的戊糖是核糖,RNA,的,U,替代,DNA,中的,T,，,此外，,RNA,中常有一些稀有碱基。, 天然,RNA,分子都是单链线形分子，只有部分区域是,A-,型双螺旋结构。,Transfer RNA,Small polynucleotide chains - 73 to 94 residues each,Several bases usually,methylatedmethylated,Each a.a. has at least one unique,tRNA,which carries the a.a. to the ribosome,3-terminal sequence is always CCA-a.a.,Aminoacyl,tRNA,molecules are the substrates of protein synthesis,假,尿嘧啶核苷,二氢,尿嘧啶核苷,胸腺嘧啶核糖核苷,4-,硫尿核苷,次黄嘌呤核苷,1-,甲基鸟苷,N-6-,异戊烷腺苷,二级结构： 三叶草型,氨基酸臂,二氢尿嘧啶环,反密码环,额外环,TC,环（假尿嘧啶环）,三级结构： 倒,L,形（酵母,tRNA,phe,),tRNA,的功能：,转运氨基酸,识别密码子,参与翻译起始,参与,DNA,的反转录,参与基因表达调控,（三）,mRNA,的结构,原核：多顺反子（,polycistronic,mRNA),真核：单顺反子，断裂基因（,splited,gene),Eukaryotic mRNA,DNA is transcribed to produce heterogeneous nuclear RNA,（,hnRNA,核内不均一,RNA,）,mixed,introns,and,exons,with poly A,intron,- intervening sequence,exon,- coding sequence,poly A tail - stability?,Splicing produces final mRNA without,introns,5-,帽子：,m,7,G,5,-ppp,5,-Nm,（,Nm,）,p-,O,型：,m,7,G,5,-ppp,5,-Np-,I,：,m,7,G,5,-ppp,5,-Nmp-Np-,II: m,7,G,5,-ppp,5,-Nmp -,Nmp,-,Np,-,甲基鸟苷,5,，,5-,三磷酸,（四）,rRNA,的结构,细菌,：,16S,rRNA,、,5S,rRNA,、,23S,rRNA,组成,30S,转录单位,真核：,18SrRNA,、,5.8S,rRNA,，,28S,rRNA,组成,45S,的转录单位，,5S,rRNA,单独转录。,Ribosomes,are about 2/3 RNA, 1/3 protein,rRNA,serves as a scaffold for ribosomal proteins,23S,rRNA,in,E. coli,is the,peptidyl,transferase,!,大肠杆菌,5S,rRNA,结构,P498,图,13-20 16S,、,5S,rRNA,的结构,rRNA,的功能：,组成核糖体,催化肽键形成的转移酶活性存在于,23SrRNA,上,参与,tRNA,与,mRNA,的结合,第三节 核酸的物理化学性质,一、核酸的水解,（一）酸水解,对酸的敏感性：糖苷键磷酸酯键,嘌呤糖苷键嘧啶糖苷键,利用酸水解可以研究核酸的碱基组成,（二） 碱水解,RNA,的磷酸酯键对碱敏感,室温，,0.31mol/L KOH,，,24h,，,可将,RNA,完全水解。,DNA,抗碱水解,生理意义：,DNA,更稳定 ，遗传信息。,RNA,是,DNA,的信使，完成任务后迅速降解。,（三） 酶水解,非特异的磷酸二酯酶：,蛇毒磷酸二酯酶水解,DNA,（,RNA,）,得,5-,核苷酸,牛脾磷酸二酯酶水解,DNA,（,RNA,）,得,3-,核苷酸,特异的磷酸二酯酶：核酸酶,1,、,核酸酶的分类,底物专一性：,核糖核酸酶,RNase,脱氧核糖核酸酶,DNase,作用方式：,核酸外切酶（,exonuclease,),、,核酸内切酶,(,endonuclease,),单链核酸酶、双链核酸酶、杂链核酸酶,磷酸二酯键的断裂方式：,5-,（,寡）核苷酸,3-,（寡）核苷酸,2,、,RNAase,RNase,H,作用于,DNA-RNA,中的,RNA,链,牛胰核糖核酸酶（,pancreatic,ribonuclease,) ,RNase,I,最适,pH,：,7.0-8.2,产物：以,3-,嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸，高度专一的内切酶,RNase,T1,耐热、耐酸,产物：以,3-,鸟苷酸结尾的寡核苷酸，专一性更高,RNase,T2,产物：以,3-,腺苷酸结尾的寡核苷酸,3,、,DNase,核酸酶,S1,作用于单链,DNA,部分,牛胰核糖核酸酶，,DNase,I,切断双链或单链,DNA,产物：以,5-,磷酸为末端的寡核苷酸,5,、,DNA,限制性内切酶,(,Restriction Enzymes),在细菌中发现，主要降解外源,DNA,。具有严格的碱基序列专一性,Bacteria have learned to restrict the possibility of attack from foreign DNA by means of restriction enzymes,Type II and III restriction enzymes cleave DNA chains at selected sites,Enzymes may recognize 4, 6 or more bases in selecting sites for cleavage,An enzyme that recognizes a 6-base sequence is a six-cutter,二、 核酸的酸碱性质,磷酸和碱基均能发生两性解离。,DNA,等电点,44.5,RNA,等电点,22.5,三、 核酸的紫外吸收,碱基、核苷、核苷酸和核酸在,240290nm,的紫外波段有强烈的光吸收，,max,=260nm,1,、,鉴定纯度,纯,DNA,的,A,260,/A,280,应为,1.8,（,1.65-1.85,）,纯,RNA,的,A,260,/A,280,应为,2.0,。,若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则,A,260,/A,280,比值明显降低。,2,、 含量计算,A,值为,1,相当于：,50ug/mL,双螺旋,DNA,或：,40ug/mL,单链,DNA,（或,RNA,）,或：,20ug/mL,寡核苷酸,四、 核酸的变性、复性及杂交,(,Denaturation,、,Renaturation,and Hybridization),(,一,) DNA,变性,(,Denaturation,of DNA),核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。,Denaturation,of DNA,Double-stranded DNA,A-T rich regions,denature first,Cooperative unwinding,of the DNA strands,Strand separation,and formation of,single-stranded,random coils,Extremes in pH or,high temperature,变性因素 ：,热变性,酸碱变性（,pH,小于,4,或大于,11,）,变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）,变性后的理化性质 ：,260nm,吸收值升高。,粘度降低，浮力密度升高。,二级结构改变，部分失活。,增色效应与减色效应,增色效应：在,DNA,的变性过程中，摩尔吸光系数增大,减色效应：在,DNA,的复性过程中，摩尔吸光系数减小。,DNA,的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。,1,、 熔解温度（,Tm,）：,DNA,的双螺旋结构失去一半时对应的温度。,DNA,的,Tm,一般在,8295,之间,2,、,影响,DNA,的,Tm,值的因素,DNA,均一性 。,均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析,DNA,的均一性 。,G-C,含量与,Tm,值成正比。,测定,Tm,，,可推知,G-C,含量。,G-C%=,（,Tm-69.3,）,2.44,介质中离子强度,离子强度高，,Tm,高。,(,二,),复性,(,Renaturation,),变性,DNA,在适当（一般低于,Tm2025,）,条件下，两条链重新缔合成双螺旋结构。,DNA,reassociation,(,renaturation,),Double-stranded DNA,Denatured,single-stranded,DNA,Slower, rate-limiting,second-order process of finding,complementary sequences,to,nucleate base-pairing,Faster,zippering,reaction,to,form long,molecules,of double-,stranded,DNA,热变性,DNA,在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复性。,DNA,片段越大，复性越慢；,DNA,浓度越大，复性越快。,复性速度可用,Cot,衡量,Co,为变性,DNA,原始浓度,molL,-1,，,t,为时间，以秒表示。,P352,图,5-22,，不同,DNA,的复性动力学曲线。,Cot,1/2,表示复性一半的,Cot,值。,根据复性动力学可以测定基因组的大小和重复序列的拷贝数,(,三,),核酸的杂交,加热,双链,DNA,单链,DNA,杂交,杂化双链,在,DNA,复性过程中,双链分子的再形成既可以发生在序列完全互补的核酸分子之间,也可以发生在碱基序列部分互补的不同的,DNA,之间或,DNA,与,RNA,之间,这种现象称为,分子杂交,。,核酸杂交可以是,DNA-DNA,，,也可以是,DNA-RNA,杂交。,不同来源的，具有大致相同互补碱基顺序的核酸片段称为,同源顺序,。,利用核酸的分子杂交，可以确定或寻找不同物种中具有同源顺序的,DNA,或,RNA,片段。,第四节 核酸研究技术,一、 核酸的分离纯化和定量,尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。,条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。,抑制核酸酶。,（三）核酸的定量,P514,紫外分光光度法,硫酸 钼酸 还原剂,定磷法 有机磷,P ,磷钼酸 钼蓝,盐酸 苔黑酚,定糖法,RNA ,糠醛 鲜绿色物,盐酸,定糖法,DNA ,蓝色物,二苯胺,二、核酸的沉降特性与超速离心,不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用,Cs-,Cl,密度梯度离心可以将不同构象,DNA,、,RNA,与蛋白质区分开来,这一方法常用于质粒,DNA,的纯化。,（一）密度梯度超速离心测定核酸的浮力密度：,8M,CsCl,，,45000rpm,，,16h,密度梯度：,1.80g/ml1.55g/ml,平衡时：浮力密度,=,CsCl,密度,=,离心力,=,0,+4.2,2,（,r,2,- r,0,2,）, 10,-10,：,浮力密度,0,：为标准,DNA,的密度,：,角速度（弧度,/,秒）,r,：,样品到转轴的距离,（二）密度梯度超速离心测定,DNA,的,G-C,含量,G-C,含量与,DNA,的浮力密度之间呈正比关系,=0.1,x,G,-C,+ 1.658,x,G,-C,=,（,-1.658,）, 10,但是,5-,甲基胞嘧啶多的,DNA,，,其实际浮力密度会降低，低于理论值。,（,三）密度梯度超速离心研究核酸的构象,RNA,DNA,变性,DNA,双链,DNA,蛋白质，,变性程度越大，浮力密度越大,（,四）密度梯度超速离心纯化,RNA,或不同构象,的,DNA,超螺旋,DNA,或,三、 核酸的凝胶电泳,（一） 琼脂糖电泳,用于大片段,DNA,的分离，精度低，但分离范围广,影响迁移率的因素：,核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比,凝胶浓度,DNA,的构象，超螺旋最快，线形其次，环形最慢。,电压，不大于,5V/cm,染色：,0.5ug/ml EB,RNA,的琼脂糖凝胶电泳一般要加入甲醛或戊二醛,琼脂糖电泳可以用于,DNA,分子量的测定,琼脂糖电泳可以用于,DNA,的制备与纯化,（,二）,PAGE,电泳,用于小片段,DNA,的分析，精度非常高,六、,DNA,聚合酶链式反应,Polymerase Chain Reaction,PCR,PCR,是以,DNA,聚合酶在体外扩增,DNA,片断技术，经历,DNA,变性、退火、聚合酶催化,DNA,链的延伸等三个步骤周而复始的过程。,1993,Dr.,Kary,Mullis discovered the PCR procedure, for which he was awarded the Nobel prize,.,