第九章 抗生素类药物的分析

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第九章,抗生素类药物分析与生物检定法,第九章,抗生素类药物分析与生物检定法,基本要求：,了解药物的特点及效价的表示方法，掌握抗生素的鉴别方法，熟悉抗生素含量的理化测定方法，熟悉微生物检定方法的原理及种类，掌握抗生素效价测定的计算式，熟悉影响抗生素效价测定的因素，了解管碟法测定的操作步骤，了解管碟法测定所使用的基本设备、用具和试验材料，理解总体与样本、概率、自由度、标准差、变异系数、标准误、,t,值、可信限、误差项、回归的统计含义，掌握随机设计和随机区组设计，理解,t,测验、,F,测验和,X,2,测验，了解可靠性测验的目的，掌握生物统计法计算抗生素效价的方法。,第九章,抗生素类药物分析与生物检定法,基本内容：,第一节,抗生素类药物分析,一、抗生素药物,二、抗生素的鉴别与含量测定,第二节,抗生素效价的微生物检定法,一、微生物检定方法,二、管碟法测定效价,第三节,生物统计法在抗生素效价检定中的应用,一、基本概念,二、抗生素效价测定生物统计计算步骤,第一节,抗生素类药物分析,一、抗生素药物,1,、抗生素,抗生素,是指在,低微浓度,下即可对某些生命活动有,特异抑制作用,的化学物质。,抗生素主要是,细菌、放线菌和真菌,等微生物的,代谢产物,，对各种病原微生物有强大的,抑制或杀灭,作用。,第一节,抗生素类药物分析,2,、抗生素药物的特点及检查项目,抗生素药物具有以下特点：,（,1,）,结构、组成复杂,经过微生物发酵，化学纯化，精致，化学修饰等过程，最后制成制剂。,（,2,）,化学纯度低,同系物多，异构体多，降解物多。发酵过程不易控制。生产工艺复杂易受污染。分子结构大多不稳定，降解后疗效下降、失效或增加毒副作用。活性产物易发生变异。,（,3,）,稳定性差,抗生素分子结构中通常含有活泼基团（往往是抗生素的活性中心）。,第一节,抗生素类药物分析,抗生素药物的,检查项目,包括,：,鉴别试验,异常毒性试验,无菌试验,热原试验,降压试验,酸碱度试验,水分测定,溶液澄清度检查,效价测定,其他检测（抗生素组分、有关物质、比重度、熔点、晶型、溶媒残留量、重金属、溶出度等）。,第一节,抗生素类药物分析,3,、抗生素效价单位,抗生素效价的标示量，原则上应按,所含特定的抗菌活性部分的重量,来计算。,在应用中，抗生素类药物有效成分的表示方法，是,按照各种抗生素的特点,及,使用经验,，采用符合客观实际的效价单位表示。,常用的抗生素效价单位有,重量单位,、,类似重量单位,、,重量折算单位,、,特定单位,。,第一节,抗生素类药物分析,（,1,）,重量单位,以抗生素中所含,特定的抗菌活性部分,（纯游离碱或游离酸）的重量,1g,作为,1,单位,，即,1mg=1000,单位。,如链霉素、红霉素、卡那霉素、新霉素、庆大霉素、土霉素；氯霉素、新生霉素酸、利福霉素,SV,等均以重量单位表示。,用这种方法表示，,对不同有机酸根,的同一抗生素，只要,单位一样,或有效部分重量一样，则这一抗生素的各种盐类虽然,称重不同,，但实际有效含量是相同的。,第一节,抗生素类药物分析,（,2,）,类似重量单位,以特定的纯抗生素,制品盐的重量,1g,作为一个单位，即,1mg,1000,单位，其中包括了无抗菌活性的酸根在内,。,如四环素盐酸盐（包括无生物活性的盐酸根在内）。,这种类似重量单位，,虽,然并,不合理,，但在国际上已经,习惯沿用,。,（,3,）,重量折算单位,以特定的,纯抗生素制品,的,某一重量为一个单位,而加以,折算,。,如青霉素国际标准品（,1952,年）,青霉素,G,钠,称重,0.5998g,为,1,单位,，即,1mg=1670,单位，则,80,万单位的青霉素,G,钠称重应为,0.48g,。,第一节,抗生素类药物分析,（,4,）,特定单位,以一,特定量,的抗生素,标准品,（或对照品）作为,1,单位。,如第一批杆菌肽国际标准品（,1953,年）杆菌肽,A,为,1mg=55,单位。,制霉菌素（,1963,年）为,1mg=3000,单位等。,这类抗生素的效价单位的,精确定义很难确定,，,折算效价也难以计算,，只能以,国际标准品,的效价单位，作为比较的基准。,目前，抗生素的剂量原则上以,纯品的重量表示,，并,加注单位,。如土霉素,0.25g,（,250000,单位）；但个别品种仍以习惯沿用，如青霉素仍用单位表示剂量。,第一节,抗生素类药物分析,4,、抗生素微生物检定用标准品,标准品,是指与商品,同质,且,纯度较高,的抗生素，每,1mg,含有一定的活性单位，用作供试品效价测定时的标准。,国际标准品,是经过国际,有关机构协议认定,的每,1mg,含有一定单位的标准品。其单位称为,国际单位,。,抗生素标准品效价单位的含义，世界各国应一致。,抗生素的国际标准品是在,联合国世界卫生组织生物检定专家委员会,主持下，委托,英国（伦敦）国立生物标准检定所,负责（如标准品原料的挑选、理化分析、分装与分发等）。,第一节,抗生素类药物分析,国际标准品效价单位的,标定,由,世界卫生组织,邀请有条件的,国家检定所,或,药厂实验室,，对准备作为国际标准品的抗生素，进行,协作效价标定,，然后通过,统计分析,，观察标定结果的误差和真实性，最后由,生物检定专家委员会通过决定,。,我国自,1976,年起参加了部分品种的国际协作标定。,国际标准品,主要提供各国在,标定,本国,国家标准品,时作对照品。,凡国际上已制备的国际标准品的品种，在制备国家标准品时，,均应与国际标准品比较而确定效价,。,第一节,抗生素类药物分析,我国抗生素国家标准品就是按上述原则制订的。,但是我国,的特有品种,则以理论上的,纯品一定量定为,1,个单位,，即为,1g,，以,某批精制纯品作为原始标准品,，再去,标定,暂行标准品或国家标准品。,我国药典和部颁标准所规定的,抗生素效价检定用标准品,，是由,中国人民共和国卫生部,主持，由,中国药品生物制品检定所,统一负责，与国内有关的,药检所,或,药厂,对原料进行选择，,理化分析,、,协作标定效价单位,、,分装,、,稳定性考查,、,分发,等工作。,每批标准品都有,有效期,的规定。,第一节,抗生素类药物分析,表,9-1,常用抗生素理论效价和国家规定产品效价,第一节,抗生素类药物分析,表,9-1,常用抗生素理论效价和国家规定产品效价,（续）,第一节,抗生素类药物分析,二、抗生素的鉴别与含量测定,1,、抗生素的鉴别,抗生素包括很多种类，如,-,内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、氯霉素类、多肽类、抗肿瘤类、林可霉素类、其他抗生素类等。,这里以,-,内酰胺类抗生素,为例，讲述抗生素的鉴别方法。,该类抗生素包括,典型,-,内酰胺类抗生素,，如青霉素类（,Penicillins,）、头孢菌素类（,Cephalosporins,）；,非典型,-,内酰胺类,如克拉维酸（,clavulanicacid,）、噻纳霉素（,Thienamycin,）和,Sulfazecins,等。,第一节,抗生素类药物分析,它们的分子结构特征是分子中含有,-,内酰胺环,。,该类抗生素的鉴别方法分为,呈色反应,、,各种盐反应,、,光谱法,、,色谱法,和,酶法,。,第一节,抗生素类药物分析,（,1,）,呈色反应,羟肟酸铁反应,在,碱性溶液,中与,羟胺,作用，,-,内酰胺环破裂生成,羟肟酸,，在稀酸中与,高铁离子呈色,。,茚三酮反应,含有,-,氨基的抗生素。,双缩脲反应,含有,-,氨基的抗生素。,第一节,抗生素类药物分析,与,H,2,SO,4,-HNO,3,反应,侧链含有苯羟基基团时，能与重氮苯磺酸试液产生偶合反应而呈色。如：,本类药物还可与变色酸,-,硫酸、硫酸,-,硝酸、铜盐等试剂反应产色。,与变色酸,-,硫酸反应,青霉素、阿莫西林、氨苄西林含有活泼,“-CH,2,-”,。,第一节,抗生素类药物分析,与,变色酸,-,硫酸反应,青霉素、阿莫西林、氨苄西林含有活泼,“-CH,2,-”,。,与,铜盐反应,第一节,抗生素类药物分析,（,2,）,各种盐的反应,焰色反应及验证,遇酸生成沉淀,有机胺盐反应,（芳伯氨基）,第一节,抗生素类药物分析,（,3,）,光谱法,IR,法,-,内酰胺环：,仲酰胺,：,羧酸,：,第一节,抗生素类药物分析,UV,法,样品、分解产物光谱图，,max,，,min,，,，,A,。,头孢氨苄：,max,=262nm,青霉素,V,钠：,A,280nm,/A,264nm,=1.30,1.50,第一节,抗生素类药物分析,（,4,）色谱法,对照品对照法,TLC,法,HPLC,法,比较二者主峰的保留时间是否一致。,第一节,抗生素类药物分析,（,5,）,酶法,青霉素酶法试验：,第一节,抗生素类药物分析,2,、抗生素类药物含量的理化测定法,抗生素类药物含量分析的测定方法分为,理化方法,和,生物学方法,。,理化方法以化学、物理化学方法测定主药含量，,准确度高,、,简单,、,快速,，但,不一定代表生物效价,，且,易受杂质干扰,。,生物学方法主要是通过测定抗生素抑菌或杀菌的能力来表达其效价，,与临床效果一致,，,灵敏度高,，,干扰物质少,，但,操作繁琐,、培养,时间长,、测定,误差大,。,第一节,抗生素类药物分析,（,1,）,容量法,（,capacity test,）,容量分析是依据已知浓度的标准试剂溶液与被测定的一定量供试品药物,完全作用所消耗的标准试剂的体积,，来计算被测定药物中有效物质含量的方法。,在抗生素类药物分析中，常用的有,酸碱滴定法,、,碘量法,。,第一节,抗生素类药物分析,酸碱滴定法,用于酸性抗生素类药物的,总酸量,测定。,常用的方法有：,直接滴定法,，即用已知浓度的碱标准溶液直接滴定抗生素供试品溶液；,逆滴定法,（剩余滴定法），即用一定量的已知浓度的碱标准溶液与抗生素供试品,中和后生成盐,，用已知浓度的,酸标准溶液滴定剩余的碱,。,根据酸碱中和反应时的,摩尔数关系,计算供试品中抗生素的含量。,简便快速，,不适用于有残留酯的产品,。,第一节,抗生素类药物分析,例,1,青霉素含量的测定,青霉素在水溶液中经水解后，产生青霉噻唑酸，可用酸碱滴定法测定。或用直接滴定法，或用逆滴法进行测定，最后均以,碱标准溶液的消耗量,来计算青霉素的含量。,第一节,抗生素类药物分析,终点观察：用目视指示剂或电位滴定均可。,温度,对指示剂的变色范围有影响。,碱性指示剂,，,温度升高,时，对氢离子的,灵敏度降低,，变色范围偏向较低的,pH,值，如甲基橙在室温时为,pH 3.1,4.4,，在,100,时，移到,2.5,3.7,。,酸性指示剂对温度的影响不太敏感。,指示剂的,用量不宜多,，过多时，因指示剂本身也消耗酸或碱，,变色较慢,。,在水溶液中，大部分羧酸在,pH,约,8.4,时中和，一般可用,酚酞指示剂,（无色到红色），也可采用,百里酚酞,（无色到蓝色）或,百里酚蓝,（黄色到蓝色）等。,第一节,抗生素类药物分析,滴定剂的选择，一般选用,氢氧化钠,或,氢氧化钾,标准溶液作滴定剂。,标准碱液一般采用,新沸冷却蒸馏水,进行稀释制备。,贮存,标准碱液,的容器要密封，以免吸收,二氧化碳,而影响碱液质量。,第一节,抗生素类药物分析,例,2,青霉素钠的含量测定,精密称取本品约,0.3,0.4g,，加新沸过的蒸馏水,20mL,使其溶解，加,0.01mol/L,氢氧化钠液中和后，精密加,0.1mol/L,氢氧化钠液,25mL,，,95,左右水浴,20min,。,冷却后，加酚酞指示剂,2,滴，用,0.1mol/L,盐酸滴定，从粉红色至无色。,不加供试样品作为空白，重复以上操作。,两者滴定数的差即为所消耗氢氧化钠的量。,第一节,抗生素类药物分析,计算：,式中，,M,HCl,表示,0.1mol/L,盐酸液的准确摩尔数；,A,表示供试品滴定所需,0.1mol/L,盐酸液体积（,mL,），,B,表示空白滴定所需,0.1mol/L,盐酸液体积（,mL,）。,讨论,：水解前先中和溶剂和样品；空白试验校正（消除,CO,2,干扰）；加热时避免吸收,CO,2,。,第一节,抗生素类药物分析,（,2,）光谱学测定法,旋光法,（,whirl ray method,）,平面偏振光,通过含有某些,光学活性,的化合物液体或溶液时，能引起,旋光现象,，使偏振光的平面向左或向右旋转。,偏振光平面旋转的度数,，称为,旋光度,。,使偏振光,向右旋转,（顺时针方向）为,右旋,，以,“,”符号表示；使偏振光向左旋（逆时针方向）为,左旋,，以,“,”符号表示。,偏振光透过长,1dm,并,每,1mL,中含有旋光物质,1g,的溶液，在,一定波长与温度下,测得的旋光度称为,比旋度,。,第一节,抗生素类药物分析,（,2,）光谱学测定法,旋光法,（,whirl ray method,）,平面偏振光,通过含有某些,光学活性,的化合物液体或溶液时，能引起,旋光现象,，使偏振光的平面向左或向右旋转。,偏振光平面旋转的度数,，称为,旋光度,。,使偏振光,向右旋转,（顺时针方向）为,右旋,，以,“,”符号表示；使偏振光向左旋（逆时针方向）为,左旋,，以,“,”符号表示。,偏振光透过长,1dm,并,每,1mL,中含有旋光物质,1g,的溶液，在,一定波长与温度下,测得的旋光度称为,比旋度,。,第一节,抗生素类药物分析,-,内酰胺类抗生素分子中含,不对称碳原子,，可通过比旋度的测定求取供试品的纯度。,旋光法亦用于,红霉素、螺旋霉素,等的效价测定。,第一节,抗生素类药物分析,分光光度法（,spectrophotometer method,）,分光光度法,是在,特定波长,或一定波长范围内测定被测物质的光吸收度，对该物质进行定性或定量的分析方法。,Beer-Lambert,定律,是光吸收度测量的理论基础。,单色光束,穿过被测物质溶液时，被该物质,吸收的量,（光吸收度）与该物质的,浓度,和,液层厚度,成,正比,。,第一节,抗生素类药物分析,式中，,A,表示,吸收度,；,T,表示,透光率,；,表示,百分吸光系数,（,比吸光系数,），即溶液浓度为,1,，液层厚度为,1cm,时的吸收度；,C,表示,100mL,溶液中所含被测物质的质量,，,g,；,L,表示,液层厚度,，,cm,。此外，,还可利用,摩尔吸光系数,（,Lmol,-1,cm,-1,）和,吸光系数,a,（,Lg,-1,cm,-1,）进行,A,的测定。,第一节,抗生素类药物分析,用于含量测定的方法有下述几种：,A,、,对照品比较法,按药典规定的方法，分别配制供试品和对照品溶液，,对照品,溶液中所含被测成分的量应为,供试品,溶液中被测成分标示量的,100,+10,。,所用溶剂完全一样，在规定的波长处,测定,供试品溶液和对照品溶液的,吸收度,后，按下式计算供试品中被测溶液的浓度。,C,s,表示供试品溶液浓度；,A,s,表示供试品溶液吸收度；,C,r,表示对照品溶液浓度；,A,r,表示对照品溶液吸收度。,第一节,抗生素类药物分析,B,、,标准曲线法,取数份,梯度量的对照品,（标准品）溶液，用溶剂补充至同一体积，测定每份的吸收度。,以吸收度与浓度关系,绘制标准曲线,。,将供试品,配制成标准曲线范围内的浓度,，在同样条件下处理和测量其吸收度，再在标准曲线上求出含量。,第一节,抗生素类药物分析,C,、,吸收系数法,若,供试品与,已知百分吸光系数,的纯品为同样物质时，可按药典规定方法,配制供试品溶液,，测定供试品的吸收度,A,，,求出供试品的百分吸光系数,，再求得供试品中该物质的含量。,供试品含量（）,=,E,t,/,E,s,100%,其中，,E,s,表示纯品的百分吸光系数；,E,t,表示测得的供试品的百分吸光系数。,第一节,抗生素类药物分析,紫外,分光光度法多用于,抗生素制剂中抗生素含量,的,测定,。,如测定,奥格门汀,（复合制剂）中,羟氨苄青霉素,和,克拉维酸,的含量；测定,麦迪霉素胶囊,中,麦迪霉素,的含量；用金属离子络合物测定土霉素制剂中的,土霉素,含量等等。,比色法,用于多种抗生素的,效价测定,。,如青霉素和头孢菌素的,羟胺比色法,测定抗生素效价；链霉素的,麦芽酚法,测定链霉素效价；,三氯化铁比色法,测定土霉素效价等。,第一节,抗生素类药物分析,（,3,）,色谱法测定法,色谱法在抗生素药物分析中，主要用于,鉴别定性及定量,（如杂质、异构体的限度试验和组分分析）。,第一节,抗生素类药物分析,（,4,）高效液相测定法,在每种抗生素进行检测前要求对仪器进行,系统适应性试验,，即用,规定的对照品,对仪器进行试验和调整，应达到,规定的要求,；或规定分析状态下色谱柱的,最小理论板数,、,分离度,和,拖尾因子,。,高效液相色谱在抗生素类药物的,定性、定量分析,中应用的愈来愈多，如半合成青霉素、头孢菌素的衍生物的含量测定；丝裂霉素、灰黄霉素的效价测定；一些抗生素制剂中抗生素含量的测定等。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,抗生素药品的医疗作用主要是它的,抗菌活力,，而,微生物检定法,正是以抗生素的抗菌活力为指标来衡量抗生素效价的一种方法，其,测定原理与临床要求相一致,，能直接反映抗生素的医疗价值。,利用抗生素对细菌（或霉菌）的杀死或抑制的程度，设计了抗生素效价的生物检定法。,几十年来微生物检定法仍为各国药典所采用。,测定抗生素效价,的,微生物法，一般可分为,稀释法,、,比浊法,和,琼脂扩散法,等方法,。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,一、微生物检定方法,1,、,稀释法,稀释法是抗生素效价测定最简单的方法之一。,一般是在一系列的试管中用液体培养基,逐管,将抗生素做,2,倍稀释,，并于各个试管中加入,同量,的对该抗生素有,高度敏感性,的试验,菌液,。,将各个试管放置于,37,的培养箱中,培养,24h,，观察能抑制细菌生长的,最低抗生素浓度,作为测定终点。,再与,同法,测得的抗生素标准品终点做,比较,，即可求得被测定抗生素的效价。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,第二节,抗生素效价的微生物检定法,式中，,A,为供试品的效价（,U/mL,）；,T,为供试品的抑菌最大稀释倍数；,S,为标准品的抑菌最大稀释倍数；,C,为每,mL,标准品溶液中所含单位数。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,设,C=40U/mL,，则,本法测定误差较大，各国药典均未收载，一般用于,测定,抗生素对试验菌的,最低抑菌浓度,或,最低杀菌浓度,。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,2,、,比浊法,细菌生长产生的,浊度,与,细菌数的增加,、,细菌群体质量的增加,和,细菌细胞容积,的增加之间，存在着相关性，在一定的范围内符合比耳定律。,将,抗生素,标准品的稀释液与供试品的稀释液分别,加入试管,中，再,加入,已接种,试验菌,的液体培养基，摇匀，置,37,的培养箱中,培养,24h,后，观察试验菌生长情况。,由于抗生素,浓度不同,，试验菌受抑制的程度也不同，因而产生,不同程度的混浊,。,用分光光度计测定其,透光,率,或,吸收度,，用标准曲线法可测定出供试品的效价。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,取每,mL,含,24.0,、,26.8,、,29.9,、,33.5,和,37.5U,的链霉素标准品溶液各,1mL,，分别加入,15,支试管中,(3,个平行,),。另取试管,3,支，每管中各加入供试品溶液,1mL,。,于,18,支试管中各加入已接种试验菌的液体培养基,9mL,，,摇匀。,将标准品管和供试品管置,37,培养箱中,培养,2,4h,后，取出，分别于每管中各加入,12,甲醛溶液,0.5mL,，摇匀，即可于分光光度计上,530nm,处,以,未接种试验菌的液体培养基,9mL,，加,蒸馏水,1mL,，,12,甲醛溶液,0.5mL,，摇匀作为空白，测定各管内培养物的,透光,率,。,以透光度为纵坐标，链霉素浓度为横坐标,绘制标准曲线,，则可在标准曲线上查出供试品的效价。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,3,、琼脂扩散法,(diffuse method,即管碟法,),管碟法是目前国际上测定抗生素效价的,通用方法,。,我国药典收载的微生物检定法也是,管碟法,。,此法,灵敏度高,，但,操作较麻烦,，影响试验结果的因素较多，需要从各个操作步骤严格控制试验条件，尽可能减小试验误差，才能使试验结果达到精密、准确。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,二、管碟法测定效价,1,、管碟法的原理,管碟法是利用抗生素在,摊布特定试验菌,的,琼脂培养基,内扩散，形成含一定浓度抗生素的,球型区,，抑制了试验菌的繁殖，通过透明琼脂培养基，可观察到,透明的抑菌圈,。,在一定的抗生素浓度范围内，,对数浓度,（剂量）与,抑菌圈面积,或直径,成正比,。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,方法设计是在,同样条件下,将已知效价的标准品溶液与未知效价的供试品溶液的剂量反应（抑菌圈）,进行比较,；,当,标准品和供试品,是属于同一性质的抗生素时，标准品溶液和供试品溶液，对一定试验菌所得的,剂量反应曲线,，在一定剂量范围内应,互相平行,。,根据以上原理，可设计为,一剂量法,、,二剂量法,及,三剂量法,等，从而可以较为准确地测定供试品的效价。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,2,、抑菌圈的形成,根据抗生素在琼脂培养基中的扩散现象，可总结为方程式：,换成常用对数：,抗生素的,最低抑菌浓度,（,C,）、琼脂,培养基厚度,（,H,）、抗生素在琼脂培养基内的,扩散系数,（,D,）和细菌,生长到显示抑菌圈的时间,（,t,）,。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,第二节,抗生素效价的微生物检定法,3,、抗生素效价测定的计算式,效价测定常用的方法有一剂量法、二剂量法和三剂量法。,（,1,）,一剂量法,（标准曲线法）,设,M,为标准品剂量,，,M,为供试品剂量，,S,为标准品所致的抑菌圈,，,T,为供试品所致的抑菌圈。标准品剂量,、,供试品剂量与抑菌圈的关系,依次,为,第二节,抗生素效价的微生物检定法,因,为截距，,标准品与供试品,在同一菌层平板上进行试验，,此值应相等,。故,设,表示供试品与标准品的效价比率，即,则,供试品与标准品效价比率的对数值等于,斜率,乘供试品抑菌圈直径与标准品抑菌圈,直径平方值之差,。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,（,2,）,二剂量法,取制备的,双碟不得少于,4,个,，在每,1,双碟中,对角,的,2,个不锈钢小管中分别滴装,高浓度,及,低浓度,的标准品溶液，其余,2,个小管中分别滴装相应的高低两种浓度的供试品溶液；,高、低浓度的,剂距为,2:1,或,4:1,在规定条件下培养后，测量各个抑菌圈的直径（或面积）,。,照生物检定统计法中的（,2:2,）法进行,可靠性测验、效价及可信限计算,。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,设,S,2,=,高剂量标准品,所产生抑菌圈的半径；,S,1,=,低剂量标准品所产生抑菌圈的半径；,T,2,=,高剂量供试品,所产生抑菌圈的半径；,T,1,=,低剂量供试品所产生抑菌圈的半径；,M,2,=,标准品高剂量；,M,2,=,供试品高剂量；,M,1,=,标准品低剂量；,M,1,=,供试品低剂量。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,因此，用,抑菌圈直径,直接计算效价，可避免用抑菌圈半径平方值的麻烦，故上式可简化为,当效价测定，,用几个双碟为一组时,，则可用抑菌圈直径的总和代入下式表示。,当剂距为,2,1,时，,；当剂距为,4,1,时，,第二节,抗生素效价的微生物检定法,（,3,）三剂量法,取制备并放置,6,个不锈钢小管,的,双碟数个,（不得少于,6,个，在每,l,双碟中间隔的,3,个不锈钢小管中分别滴装高浓度（,M,3,）、中浓度（,M,2,）、低浓度（,M,1,）的标准品溶液，其余,3,个小管分别滴装相应的高浓度（,M,3,）、中浓度（,M,2,）、低浓度（,M,1,）的供试品溶液,。,三种浓度的剂距,1:0.8,或,1:0.88,。,在规定的条件下培养后，测量各个抑菌圈的直径（或面积），照生物检定统计法中的（,3:3,）法进行可靠性测验、效价及可信限计算。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,设,S,3,=,高剂量标准品,所产生抑菌圈的半径；,S,2,=,中剂量标准品所产生抑菌圈的半径；,S,1,=,低剂量标准品所产生抑菌圈的半径；,T,3,=,高剂量标准品所产生抑菌圈的半径；,T,2,=,中剂量供试品所产生抑菌圈的半径；,T,1,=,低剂量供试品所产生抑菌圈的半径；,M,3,=,标准品高剂量；,M,2,=,标准品中剂量；,M,1,=,标准品低剂量；,M,3,=,标准品高剂量；,M,2,=,供试品中剂量；,M,1,=,供试品低剂量。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,当效价测定，,用几个双碟为一组时,，可将抑菌圈直径的总和或面积的总和代入式,I,随所用剂距而定,。当剂距为,1,0.8,时，,；当剂距为,1,0.88,时，,。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,4,、影响抗生素效价测定的因素,（,1,）,试验菌种,当试验菌种中含有对抗生素敏感度不同的两种或两种以上的菌株时，由于各菌株的最低抑菌浓度不同，在形成抑菌圈时可能出现双圈及边缘不清，影响测量抑菌圈的准确度。,因此，应,定期,将试验菌种进行,平板分离,。经涂片镜检后，挑选典型的单个菌落作为工作用菌种。,陈旧的试验菌培养物也会使抑菌圈边缘模糊不清，故试验时应用,新鲜制备的试验菌液,。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,（,2,）,培养基,培养基的质量,对抑菌圈的大小和清晰度都有影响，故对配制培养基用的几种主要原材料如胨、肉膏、酵母膏及琼脂等都应通过,预试验选择适宜的品种,使用。,琼脂的使用量,须,随季节,不同加以,调整,，使培养基的硬度合适，太软小钢管容易下陷，太硬容易造成抗生素溶液从小钢管底部漏出，可使抑菌圈破裂。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,（,3,）,双碟的制备,铺双碟,底层培养基,时，培养基的,温度不宜过高,，一般将融化后的培养基在室温冷至约,70,时加入双碟中为宜，否则加双碟盖后，底层培养基上会出现冷凝水。当铺,菌层培养基,时，由于,冷凝水,的局部冷却和稀释作用，可使菌层培养基凝固后表面不平。,菌层培养基一定要铺均匀,，这是决定抗生素效价测定的关键。故要求铺菌层时一定要与铺底层时双碟的位置、方向相一致。,制备菌层时，培养基的温度不要太高，受热时间也不宜过长,，特别是一些对热敏感的试验菌更要注意。否则，可使试验菌部分或全部被杀死，导致抑菌圈破裂或甚至无抑菌圈形成。因此，一定要按规定控制菌层培养基的温度。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,在双碟培养基上放置,小钢管的距离要合适,。当距离太小而抑菌圈又太大时，则相邻两个抑菌圈之间的抗生素扩散区中抗生素的浓度增大，形成互相影响的卵圆形或椭圆形抑菌圈。,在,滴加抗生素溶液至小钢管,时，若毛细滴管口不圆或有小缺口，或管内有气泡，均可使抗生素溶液从管口溅出；若加液太满，溶液会从小钢管口溢出。以上原因均会造成抑菌圈不圆整或破裂成桃形。防止的办法是,滴管口要圆整，管口不能太细，管内不能有气泡,，加液时滴管口离小钢管的距离不能太高，小钢管两端面要平。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,（,4,）,双碟的培养温度和时间,培养箱的温度要均匀，,每组双碟要放在同一层盘内,，在培养过程中，不要开启培养箱，以免影响培养箱内的温度。,双碟的,培养时间,也与抑菌圈的清晰度有关，如用黑根霉菌作试验菌种测定制霉菌素效价时，在培养过程中应注意观察，待培养至抑菌圈呈现清晰，即停止培养。如果培养时间过长，菌丝长出就会形成抑菌圈边缘不整齐。,如用藤黄八叠球菌作试验菌种测定四环素、土霉素和氯霉素等效价时，在,37,培养,16h,后，有时抑菌圈边缘不清晰，可继续培养一段时间，抑菌圈边缘的菌群继续生长并产生色素，则可使抑菌圈逐渐变清晰。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,（,5,）,抗生素污染,无抑菌圈形成的原因，大多由于抗生素污染所致。因此，在进行抗生素效价测定时，要严防抗生素污染。,防止的办法是,将配制和稀释抗生素所用的容器与制备培养基所用的容器严格分开,。,切不可将抗生素溶液撒于地面，以免抗生素附着在微小尘埃上随风飘落在双碟琼脂培养基上，而造成抑菌圈破裂或无抑菌圈形成。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,（,6,）,标准品,标准品与供试品必须是,同质的抗生素,。如标准品与供试品所含的活性物质不同，则标准品和供试品的两条剂量反应线不成平行直线关系，就不能按平行线原理公式计算效价。,各种抗生素都有它同质的标准品，决不能用这一型抗生素组分制备的标准品，去测定另一型抗生素的供试品，如不能用多粘菌素,B,标准品对比测定多粘菌素,E,供试品。,如供试品中的添加物为已知者，则应在标准品溶液中加入同量的添加物，以抵消其影响。,总之要,使标准品溶液与供试品溶液的内容物相同,。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,（,7,）,直线的斜率与截距,以抗生素对数剂量为纵坐标，以抑菌圈直径为横坐标，在一定剂量范围内，,斜率愈小,，生物反应的,灵敏度愈高,，试验结果,愈精密,。,剂量反应直线的斜率为,1/(9.21Dt),，要使斜率小，则应使,D,值、,t,值变大，即抗生素在培养基中的,扩散系数,D,要大,，试验菌的,生长时间,t,要长,。,扩散系数除了与抗生素相对分子质量有关外，还与,培养基成分,、,缓冲液的浓度,和,pH,值,以及,试验菌的菌量,等因素有关，适当控制这些因素，可增大抗生素的扩散系数。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,增大,t,值的办法，可在滴加抗生素溶液后，将双碟,置室温中放置,1,2h,，然后再置培养箱中培养。,剂量反应直线的截距为,lgC4DtH,，截距除受抗生素溶液浓度、扩散系数和试验菌的生长时间等因素影响外，主要的影响因素是,培养基的厚度,，培养基的,厚度减少,则截距随之减少，抑菌圈就相应地增大，从而提高试验的灵敏度。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,（,8,）,操作技术,管碟法是微量的微生物分析法，所需称量的抗生素样品一般很少。,如青霉素测试浓度为,1.0U/mL,即,0.0005988mg/mL,；链霉素为,0.001mg/mL,。,冰箱保存样品应放置室温，温度平衡后再启开。,称量、稀释都要求精密正确。,某些抗生素为干燥粉末，吸湿性强，,需,恒湿操作设备。,量取溶液时，要用被量取的溶液流洗,2,3,次。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,双碟小钢管的,滴加时要求滴加迅速,，如一组三个双碟,18,个小钢管的滴加时间，控制在,1min,内较好。在操作较多待检品时，以分批操作为好，切勿同时放置几排双碟先滴加好标准品溶液后滴加各批供试品溶液，这样使标准品与供试品的扩散时间和细菌生长时间带来差异，引致误差。,抑菌圈的测量,时有多种仪器供选择，如,游标卡尺,（精密度,0.02,或,0.05mm,）、,幻灯投影放大测量,、,抑菌圈面积测量仪,、,抑菌圈,（抗生素效价）,自动测量分析仪,、,多功能一体机,（菌落计数、显微细胞分析、抑菌圈测量、药敏自动分析）等。采用测量仪器不同，精密度也存在差异。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,5,、管碟法测定的操作步骤,管碟法的三种剂量法的操作方法基本相同。,以二剂量法为例简述主要操作步骤。,一般要求,高剂量,显现的抑菌圈,直径应在,20,24mm,，某些品种可放宽到,18,24mm,。,高剂量与低剂量抑菌圈直径之,差值应大于或等于,2mm,，某些品种的差值可小些。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,（,1,）,标准品供试品溶液的制备,标准品、供试品的原液（浓度,500,1000U/mL,）一般用灭菌蒸馏水溶解制备，而稀释液（亦可称滴加溶液）依据抗生素的性质，采用相应的缓冲液制备。,高低剂量的比率，一般采取高剂量低剂量,=2,1,，如果此比率下的,抑菌圈差别较小,，可采用高剂量低剂量,=4,1,的剂量比率。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,（,2,）,双碟的制备,在灭菌的平皿内先倒入底层琼脂培养基，凝固后，再倒入含有检定菌的,菌层琼脂培养基,。,在菌层培养基表面上用手工或小钢管放置器,等距离,的放置,小钢管,。,一个供试品可用,5,10,个平皿,为一个检定组。,（,3,）,滴加溶液,在每个双碟的对角两个钢管内分别滴加标准品高剂量、低剂量溶液，其余两个钢管内分别滴加供试品的高剂量、低剂量溶液。,第二节,抗生素效价的微生物检定法,（,4,）,恒温培养,滴加完毕的平皿，用陶瓦盖（最好用乙醇棉球擦擦）盖上，然后按试验菌的要求置于相应的恒温箱内培养。,（,5,）,测量抑菌圈,培养至一定时间，取出，测量抑菌圈直径或用抑菌圈面积测量仪测量。,（,6,）,计算,测试结果与统计分析将测得的各剂量的抑菌圈直径列成表格。并按效价计算式，求得供试品的,效价,。进一步用生物统计方法分析测试结果的,可信性,。,第三节,生物统计法在抗生素效价检定中的应用,用生物检定方法测定生物活性的药物均应正确地应用生物统计方法的原理进行试验设计，同时进行试验可靠性测验，可信限计算等统计分析，才能获得可靠的试验结果。,一、基本概念,1,、总体与样本,总体,是同质的个体构成的集体。从总体中取出部分个体的过程称为,“,抽样,”,，所抽得的部分称为,样本,（样品）。,在日常检验中，手头上所掌握的资料，只是总体的一小部分，是一个样本，往往从样本测得的数据来推断总体。,第三节,生物统计法在抗生素效价检定中的应用,2,、概率,概率表示一个事件发生的可能性，以,P,表示。,概率的范围在,0,与,l,之间，某一事件必然不发生则,P,=0,。,通常,1,P,0,，,P,愈接近,0,，则发生的可能性愈小，,P,愈接近于,1,，发生的可能性愈大。,3,、自由度,自由度计算方法如下：若有,N,个数值受到,r,个必要条件的限制，则其自由度为,N,r,。,第三节,生物统计法在抗生素效价检定中的应用,4,、标准差（,S,）,标准差,表示一群数值之间的差异或离散程度，是各离均差平方之和平均后开方所得值，是总体变异的参数，表示的是个体的离散程度，该数值愈小，表示总体变异小。,标准差的作用：,说明一套变量值（观察值）的离散程度，对观察频数做概括估计。计算变异值。计算标准误。,第三节,生物统计法在抗生素效价检定中的应用,5,、变异系数（,CV,）,变异系数,是标准差（,S,）对均数（,）的百分率。,当比较两组数据差异时，如果两组均数相同或相差无几，则两组内部差异程度的不同可直接比较两组的标准差。,但如果两组均数相差悬殊时，应把标准差和均数对照起来进行比较，换算成标准差相当于均数的百分率，称为,变异系数,，再行比较两组的差异。计算式：,第三节,生物统计法在抗生素效价检定中的应用,6,、标准误（,S,M,）,标准误是用来测量重复同样实验所得各次结果之间的离散情况或参差程度的。也可以说是以同法做各次实验结果间的标准差。公式：,由于标准误是衡量一群性质相同的平均值变动范围大小的指标，所以该数值愈小，说明实验精密度愈高。,第三节,生物统计法在抗生素效价检定中的应用,在生物检定实验中，不可能由许多样本的均数，然后再计算标准误。通常做估计标准误，即从一次试验的数据来估计标准误。在不同的试验设计中，估计标准误的计算公式不同，计算通式为：,第三节,生物统计法在抗生素效价检定中的应用,标准误的,应用,：测量样本均数（或率）的可靠性，,估计总体均数（或率）的可信限范围，,进行显著性测验。,标准差与标准误的,异同点,：标准差和标准误都是说明变异程度的，但标准差是表示,一套观察值,（变量值）的离散（变异）程度的指标；而标准误是说明,样本均数,离散（变异）程度的指标。,第三节,生物统计法在抗生素效价检定中的应用,7,、,t,值,用一个样本计算出来的估计标准误来代替总体标准误总是有偏差的，并且样本愈小，偏差就愈大，而,t,值就是用来纠正样本偏差的参数,。,t,值是个变量，随着样本均数和估计标准误变动。,第三节,生物统计法在抗生素效价检定中的应用,8,、可信限（,FL,）,可信限,是用来标志试验结果精密度的，它比标准误更为具体而明确地表示出实验的误差范围。,也就是在一定概率（,95,）水平下，从供试品检定的结果，估计其真实结果的所在范围。,M,的可信限是,M,的标准误,S,M,和,t,值的乘积，用,95,的概率水平。,可信限范围大，试验误差大，反之，则小。,第三节,生物统计法在抗生素效价检定中的应用,可信限相当于实验结果的百分数，,即为,可信限率（,FL,）。,在实际计算中，实验结果要通过对数值来计算，对数实验结果的可信限在换算成真数时，其高限和低限离,M,不是等距离的，因此，常用这,两个距离的平均值,为可信限，再由此而计算出的可信限率称,平均可限率,。,第三节,生物统计法在抗生素效价检定中的应用,9,、误差项（,S,2,）,是指从实验结果的总变异中分去,不同剂量及不同因级,对,变异的影响,后，,剩余的变异成分,，用,方误差,（,S,2,）表示。,对于因实验设计类型的限制无法分离的变异成分，或估计某种因级对变异的影响小，可不予分离者，都并入,S,2,，但,剂间变异必须分离,。,误差项的大小影响标准误和可信限。,第三节,生物统计法在抗生素效价检定中的应用,10,、回归,回归用于研究两个变量之间的关系。,抗生素效价测定时,对数剂量,和,抑菌圈大小,是两个变量，两者存在从属因果关系，也就是抑菌圈大小（,Y,）随着对数剂量（,X,）的高低而变化，,Y,是,X,的一个函数，在生物统计中称,Y,在,X,上的回归。,第三节,生物统计法在抗生素效价检定中的应用,11,、量反应平行线测定实验设计类型,根据不同的检定方法可加以限制的因数采用不同的实验设计类型。,常用的设计类型有,随机设计,、,随机区组设计,、,拉丁方设计,和,交叉设计,等。,（,1,）,随机设计,将,有关因子,的,各级随机分配,到,各剂量组,，各剂量,组内不加因级限制,。,本设计较为简单，计算也较方便，较为常用。主要缺点是没有考虑去除其他因级（如实验条件、碟间等）对实验误差的影响，只是分辨不同剂量（剂间）所致变异，因而,不能将实验误差减至更小,。,第三节,生物统计法在抗生素效价检定中的应用,（,2,）,随机区组设计,要求在剂量组内的各行间加以区组间（如碟间、窝间等）的因级限制。,一个区组是指性质相同的实验对象或实验条件，它可以是一窝动物、一次实验、一个培养皿上的效价测定小杯、一个动物或其器官的一组剂量结果等。,各剂量的区组数（,m,）相等，因此在安排时要使每个区组的容量（,K,）相等。,随机区组设计用二因子的方差分析法，较完全地发挥了方差分析的作用，实验误差较随机设计为小。,抗生素效价测定（管碟法）采用随机区组设计,。,第三节,生物统计法在抗生素效价检定中的应用,12,、显著性测验,实验工作中要得到可靠的结论，需将实验数据经过统计处理。,实验的对象是生物体，对药物的反应有一定差异性，再加上实验工作中其他误差，就会形成差别的假象。通过对实验数据的处理，运用生物统计方法来分析差别,又没有显著意义，即为,显著性测验,。,第三节,生物统计法在抗生素效价检定中的应用,常用的显著性测验依不同的试验设计有下面三种。,（,1,）,t,测验,常用于两个均数之间的比较,，如比较卡尺法和仪器法测量抑菌圈所得效价有显著差异，可用,t,测验来判断。,（,2,）,F,测验（方差分析）,常用于两个以上均数间的比较,。抗生素效价测定中，不论（,2.2,）法还是（,3.3,）法，比较的均数都超过两个以上。,（,3,）,X,2,测验,用于,计数资料离散程度,的判断，测验,计算值与理论值之间的偏离度,有无显著意义。,第三节,生物统计法在抗生素效价检定中的应用,常用的显著性测验依不同的试验设计有下面三种。,（,1,）,t,测验,常用于两个均数之间的比较,，如比较卡尺法和仪器法测量抑菌圈所得效价有显著差异，可用,t,测验来判断。,（,2,）,F,测验（方差分析）,常用于两个以上均数间的比较,。抗生素效价测定中，不论（,2.2,）法还是（,3.3,）法，比较的均数都超过两个以上。,（,3,）,X,2,测验,用于,计数资料离散程度,的判断，测验,计算值与理论值之间的偏离度,有无显著意义。,第三节,生物统计法在抗生素效价检定中的应用,13,、可靠性测验,（,1,）,可靠性测验的目的,抗生素效价测定属于量反应平行线测定，此测定法的计算原理是以,S,和,T,的对数剂量与反应呈直线关系以及,S,和,T,两条直线平行为基础的，因此必须验证所得实验结果,是否显著偏离,了,直线和平行性,。,对于,偏离不显著,（在一定的概率水平下）实验结果，认为,可靠性成立,，方可按有关公式计算供试品的效价和可信限。,第三节,生物统计法在抗生素效价检定中的应用,（,2,）,可靠性测验方法,实验结果的可靠性是以,方差分析,法测验，测验多组均数之间的,差别是否显著,。,抗生素效价测定中，存在有,S,和,T,的差别，直线及平行线关系，剂量间和双碟间的关系。,通过,统计以上各组均数间的方差,，以试品间、回归、剂间（列）、碟间（行）等的,F,值（,F,值,=,该项方差,/,误差项,S,2,），来确定各自差异的显著性程度和实验结果的可靠性，因此可作为观察实验显著性程度的一个指标。,计算出,F,值，可查,F,值表比较计算,F,值是处于,P,0.05,、,P,0.05,，还是,P,0.01,。,一般差别是否显著的表示方法常用：,P,0.05,，差别有显著意义；,P,0.05,，差别无显著意义。,第三节,生物统计法在抗生素效价检定中的应用,（,2,）,可靠性测验方法,实验结果的可靠性是以,方差分析,法测验，测验多组均数之间的,差别是否显著,。,抗生素效价测定中，存在有,S,和,T,的差别，直线及平行线关系，剂量间和双碟间的关系。通过,统计以上各组均数间的方差,，以试品间、回归、剂间（列）、碟间（行）等的,F,值（,F,值,=,该项方差,/,误差项,S,2,），来确定各自差异的显著性程度和实验结果的可靠性，因此可作为观察实验显著性程度的一个指标。,计算出,F,值,，可查,F,值表比较计算,F,值是,P,0.05,、,P,0.05,，还是,P,0.01,。,P,0.05,，差别有显著意义；,P,0.05,，差别无显著意义。,第三节,生物统计法在抗生素效价检定中的应用,（,3,）可靠性测验结果分析 ,试品间,（,F,1,）,本项是用以观察,S,和,T,的结果是否是显著差别。,若,差异非常显著,（,计算,F,值,F,（,f,1,f,2,）,0.01,，,P,0.05,）。,药典规定：计算所得效价，如低于估计效价的,90,或高于估计效价的,110,，应,调整其估计效价,，予以,重试,，道理也在于此。,第三节,生物统计法在抗生素效价检定中的应用,回归,（,F,2,）,该项,应非常显著,（计算,F,值,F,（,f,1,f,2,）,0.01,，,P,0.01,），表明,剂量与反应呈直线关系,，即反应随剂量呈现规律性变化，使反应均匀分布在一条直线上。当,P,0.01,时，证明实验的直线性好。,偏离平行,（,F,3,）,该项应,不显著,（计算,F,值,0.05,），表明,S,和,T,平行关系可靠。当回归项非常显著而偏离平行不显著时，则认为,S,和,T,呈平行直线关系。,第三节,生物统计法在抗生素效价检定中的应用,二次曲线,（,F,4,）与,反向二次曲线,（,F,5,）,该项是（,3.3,）法增加的观察指标，目的是考核,S,和,T,是否形成曲线，验证其直线性和平行性。,（,2.2,）法属二点成直线，只存在是否平行，而三点有可能形成曲线，所以该两项与偏离平行观察方法相同，应,不显著,（计算,F,值,0.05,），表示,S,和,T,的直线性和平行性良好。,第三节,生物统计法在抗生素效价检定中的应用,剂间,（,F,6,）,该项差异,应显著,（计算,F,值,F,（,f,1,f,2,）,0.05,，,P,0.05,），即不同剂量（浓度）所致的反应（抑菌圈直径或面积）应有明显差异，差异显著可提高检定的灵敏度，减低实验误差。,若差异不显著，可重新调整剂量或调整实验方法。,碟间,（,F,7,）,该项应,不显著,（计算,F,值,0.05,）。实验中一组双碟之间的误差应当较小，以使总的实验误差减小,。,但在一般情况下，双碟间的误差总是存在的，所以药典中可靠性测验已分辨碟间差异，使实验误差减小。,第三节,生物统计法在抗生素效价检定中的应用,综上所述，可靠性测验的结论可归纳如下：,试品间差异不显著,（,P,0.05,），,回归项非常显著,（,P,0.05,），,剂间差异显著,（,P,0.05,）。,当可靠性测验表明,S,和,T,是呈平行直线关系后，即可应用平行线测定的有关公式计算效价和可信限。,第三节,生物统计法在抗生素效价检定中的应用,二、生物统计法计算抗生素效价步骤,1,、方差分析,（,1,）将实验结果（抑菌圈直径）按表,9-4,排成方阵。其中，,k,为,S,和,T,的剂量组数和。（,2.2,）法，,k,=4,；（,3.3,）法，,k,=6,。,m,为每剂量组内抑菌圈数，即每剂量所用的碟数。,n,为抑菌圈总数，,n,=,mk,。,y,（,k,