总RNA的提取和RT-PCR

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,总,RNA,的提取、定量与,RT-PCR,南方医科大学,生物化学与分子生物学实验教学中心,完整,RNA,的提取和纯化,是进行,RNA,方面的研究工作如,Nothern,杂交,、,mRNA,分离,、,RT-PCR,、,定量,PCR,、,cDNA,合成,及体外翻译等的前提。,掌握从细胞中提取总,RNA,的方法,熟悉紫外吸收法检测,RNA,浓度与纯度的原理及测定方法,掌握,RT-PCR,基因扩增的原理和过程,目 的,实 验 流 程,提取原理,操作步骤,逆转录原理,操作步骤,提 取,总,RNA,定 量,合成,cDNA,第一链,原理体系,引物选择,PCR,电泳原理,电泳步骤,电 泳,计算方法,操作步骤,第一部分,细胞总,RNA,的提取及定量,原 理,10,-5,m,g RNA/,细胞,mRNA 3,端存在,20-250,个多聚腺苷酸,(,polyA,),结构，可用,oligo(dT,),亲和层析柱分离,mRNA,。,RNA,分离的方法,：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍,-,有机溶剂法，氯化锂,-,尿素法，蛋白酶,K-,细胞质,RNA,提取法等、,异硫氰酸胍,-,酚,-,氯仿一步法等,。,目前常用的是,Trizol,法,。,rRNA 80-85%,：,28S 18S 5S,tRNA, snRNA 10-15%,mRNA 1-5%,Trizol,的主要成分,Trizol,是一种新型总,RNA,抽提试剂,主要成分是,异硫氰酸胍,和,酚,。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白,/,核酸物质解聚得到释放。,酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制,RNA,酶活性，因此,Trizol,中还加入了,8-,羟基喹啉、,-,巯基乙醇等来抑制内源和外源,RNase,。,在加入,氯仿,离心后，溶液分为水相和有机相，,RNA,在上层水相中。,取出水相用,异丙醇沉淀,可回收,RNA,；用乙醇沉淀中间层可回收,DNA,；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。,原 理,所有,RNA,的提取过程中都有五个关键点：,样品细胞或组织的有效破碎；,有效地使核蛋白复合体变性；,对内源,RNA,酶的有效抑制,；,有效地将,RNA,从,DNA,和蛋白混合物中分离；,对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。,关 键 点,RNA,酶污染来源,RNA,酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。,严格控制外源性,RNA,酶的污染,：外源性的,RNA,酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂的污染。,最大限度地抑制内源性的,RNA,酶,：而各种组织和细胞中则含有大量内源性的,RNA,酶。,防止,RNA,酶污染的措施,所有的玻璃器皿均应在使用前于,180,的高温下干烤,6h,或更长时间。,塑料器皿可用,0.1%DEPC,水浸泡,12h,以上，高压灭菌。,有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在,3%H2O2,室温,10min,，然后用,0.1%DEPC,水冲洗，晾干。,配制的溶液应尽可能用,0.1% DEPC,在,37,处理,12h,以上。然后用高压灭菌除去残留的,DEPC,。不能高压灭菌的试剂，应当用,DEPC,处理过的无菌双蒸水配制，然后经滤膜过滤除菌。,操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，,实验过程中手套要勤换,。,设置,RNA,操作专用实验室，所有器械等应为专用。,加,样,枪,的,使,用,操作,步骤,样品处理,提取组织,RNA,时，每,50,100mg,组织用,1ml,Trizol,试剂对组织进行裂解；,悬浮细胞先离心沉淀，每,5-10 10,6,个细胞加,1ml,Trizol,后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。,培养贴壁细胞不须消化，可直接用,Trizol,进行消化、裂解，,Trizol,体积按,10cm,2,/ml,比例加入。,(,注意：,匀浆一定要彻底，是提取高质量,RNA,的前提,；细胞数量与,Trizol,的比例，细胞的数量不能过多。,),实验材料,：,HEK293,人胚肾细胞,操作步骤,细胞中加入,1 ml,Trizol,（,RNAisoPlus,）用移液枪反复吹吸直无明显沉淀后，室温放置,5min,，使其充分裂解。,（注意：此时可放入,-70,长期保持。 ）,按,200,u,l,氯仿,/ml,Trizol,加入氯仿，振荡混匀后室温放置,2-3 min,。,(,注意：此步一定要振荡混匀，使氯仿和,Trizol,不分层。,),4 12,000g,离心,15min,。样品分为三层：底层为黄色（红或绿）有机相，上层为无色水相和一个中间层。,RNA,主要在水相中，水相体积约为所用,Trizol,试剂的,60,。,（此步开始组长负责组织各组同步进行离心）,吸取上层水相，至另一新的离心管中。,一般,400-450,ul,就足够了，千万不要贪多！,（注：千万不要吸取中间界面；,若同时提取,DNA,和蛋白质，则保留下层酚相存于,4,冰箱，若只提,RNA,，则弃下层酚相。）,操作步骤,加入等体积异丙醇后，上下颠倒混匀，,4,放置,5 min,。,4 12,000g,离心,10 min,，弃上清，,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀,。,加入,1 ml 75%,乙醇,，,（切勿触及沉淀！）,温和振荡离心管，悬浮沉淀。,4 12,000g,离心,5 min,，尽量弃上清。,室温晾干或真空干燥,5 min,。,（注：,RNA,样品不要过于干燥，否则很难溶解。）,加入,10,u,l,无,RNase,的水，,充分震荡混匀,。,原 理：,物质在光的照射下会产生对光的吸收效应,而且物质对光的吸收是具有选择性的,各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱,因此不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系,.,紫外光吸收法,紫外吸收检测,RNA,的浓度,RNA,在,260nm,波长处有最大的吸收峰。因此，可以用,260nm,波长分光测定,RNA,浓度，,OD,值为,1,相当于大约,40g/ml,的单链,RNA,。用双蒸水稀释,RNA,样品,n,倍并以双蒸水为空白对照，根据此时读出的,OD260,值即可计算出样品稀释前的浓度,:,RNA (mg/ml) = 40OD260,读数,稀释倍数,(n)/1000,dsDNA,(,双链,DNA),1OD,260,= 50ug/ml,ssDNA,(,单链,DNA),1OD,260,= 33ug/ml,RNA,1OD,260,= 40ug/ml,RNA,纯品的,OD260 /OD280,的比值为,2.0,，故根据,OD260 /OD280,的比值可以估计,RNA,的纯度。,若,OD260/OD280,小于,2,，说明可能有,DNA,片段污染，可以考虑用无,RNase,的,DNase,处理样品，若小于,1.8,，说明样品中还可能含有蛋白质或酚，应再用酚,/,氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化,RNA,。若比值太高（大于,2.2,），则提示,RNA,有降解。,紫外吸收检测,RNA,的纯度,RNA,完整性检测,完整的,RNA,的甲醛电泳可明显地观察到,28S,和,18S,两条带，并且,28S,大约是,18S,的两倍宽。,若两条带不明显,则说明,RNA,部分降解,可能的原因是污染了,RNase,。,常见问题分析,RNA,得率低：,A.,样品裂解或匀浆处理不彻底。,B.RNA,沉淀未完全溶解。,A260/A2801.65,：,A.RNA,应使用,TE Buffer,稀释后再进行吸光度值的测定。,低离子浓度和低,pH,值条件下,A280,值偏高。,B.,样品匀浆时加的试剂量太少。,C.,匀浆样品时未在室温放置,5,分钟。,D.,吸取水相时混入了有机相。,E.RNA,沉淀未完全溶解。,RNA,降解,A.,组织取出后没有马上处理或冷冻。,B.,待提取,RNA,的样品没有保存于,-60,至,-70,，而保存在了,-5,至,-20,。,C.,细胞在用胰酶处理时过度。,D.,溶液或离心管未经,RNase,去除处理。,E.,电泳时使用的甲醛,pH,值低于了,3.5,。,DNA,污染,A.,样品匀浆时加的试剂量太少,B.,样品中含有有机溶剂,(,如乙醇，,DMSO,等,),，强缓冲液或碱性溶液,常见问题分析,第二部分逆转录,-,聚合酶链反应,(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,，,RT-PCR),提取组织或细胞中的总,RNA,，,以其中的,mRNA,作为模板,，采用,Oligo,（,dT,）或随机引物利用逆转录酶反转录成,cDNA,。再以,cDNA,为模板进行,PCR,扩增，而获得目的基因或检测基因表达。,RT-PCR,使,RNA,检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量,RNA,样品分析成为可能。,该技术主要用于：,分析基因的转录产物,、,获取目的基因,、,合成,cDNA,探针,、,构建,RNA,高效转录系统,。,原 理,鼠白血病病毒,（,MMLV,）,反转录酶：有强的聚合酶活性，,RNA,酶,H,活性相对较弱。,最适作用温度为,37,。,在长时间的逆转录过程中，不会造成模板的降解，获得,cDNA,的几率大，适用于较长的,cDNA,链的合成。,禽成髓细胞瘤病毒,（,AMV,）,反转录酶：有强的聚合酶活性和,RNA,酶,H,活性。,最适作用温度为,42,。,Thermus,thermophilus,、,Thermus,flavus,等嗜热微生物的,热稳定性反转录酶,：在,Mn,2+,存在下，允许高温反转录,RNA,，以消除,RNA,模板的二级结构。,MMLV,反转录酶的,RNase,H-,突变体,：商品名为,Superscript,和,SuperScript,。此种酶较其它酶能多将更大部分的,RNA,转换成,cDNA,，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的,mRNA,模板合成较长,cDNA,。,（一）反转录酶的选择,随机六聚体引物,：用此种方法时，体系中所有,RNA,分子全部充当了,cDNA,第一链模板，通常用此引物合成的,cDNA,中,96%,来源于,rRNA,。,Oligo(dT,),：是一种对,mRNA,特异的方法。因绝大多数真核细胞,mRNA,具有,3,端,Poly(A,+),尾，此引物与其配对，仅,mRNA,可被转录。由于,Poly(A+)RNA,仅占总,RNA,的,1-4%,，故此种引物合成的,cDNA,比随机六聚体作为引物和得到的,cDNA,在数量和复杂性方面均要小。,特异性引物,：是用含目标,RNA,的互补序列的寡核苷酸作为引物，用此类引物仅产生所需要的,cDNA,，导致更为特异的,PCR,扩增。,（二）引物的选择,（三）内参的设定,为了保证实验结果的可靠与准确，可在,PCR,扩增目的基因时，加入一对内参照基因的特异性引物，同时扩增内参,DNA,，作为对照。,常用的内参有,GAPDH,（,3-,磷酸甘油醛脱氢酶）,、,-Actin,（,-,肌动蛋白）,等。其目的在于避免,RNA,定量误差、加样误差以及各,PCR,反应体系中扩增效率不均一、各孔间的温度差等所造成的误差。,仪器和主要试剂,基因扩增仪、微量加样枪、灭菌超薄,PCR,反应管,总,RNA,第一链,cDNA,合成试剂盒 （含有逆转录酶、,RNA,酶抑制剂、缓冲液）,dNTP,mix,：含,dATP,、,dCTP,、,dGTP,、,dTTP,各,2,mmol,/L,操作步骤,采用,TaKaRa,PrimeScript,RT reagent Kit,合成,cDNA,第一链,按下列组分配制,RT,反应液,5X,PrimeScrip,Buffer 2,m,l,PrimeScript,RT Enzyme Mix 0.5,m,l,Oligo,dT,Primer (50,m,M) 0.5,m,l,Random 6mers (100,m,M),0.5,m,l,Total RNA 6.5,m,l,反转录反应条件如下,37,60min,（反转录反应）,85,5sec,（反转录酶失活反应）,注：反转录步骤在,PCR,仪中进行,第一链,cDNA,2,l,PerfectShot,Taq,(,绿色,),10,l,上游引物,(10,M),1,l,下游引物,(10,M),1,l,RNase,free H2O,6,l,总体积,20,l,取,0.2 ml PCR,反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂,(,注意每换一种试剂换一个新吸头,),：,如配好的反应液较多沾到管壁上，可将,PCR,反应管置台式离心机中瞬时离心，使反应液集中于管底，,然后,将反应管放到基因扩增仪,(PCR,仪,),上,.,PCR,反应体系,94,预变性,5,分钟后开始以下循环,94 30,秒,60 30,秒,30,循环,72 40,秒,72 5,分钟,4 ,保温,实验过程约,1,小时,30,分钟,PCR,参数设置,琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度,DNA,分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动,.,DNA,分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的,DNA,，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带,(,迁移速度与分子量的对数值成反比关系,).,琼脂糖凝胶电泳原理,影响迁移速率因素,1,、,DNA,的分子大小,2,、 琼脂糖浓度,3,、,DNA,分子的构象,4,、 电源电压,5,、 嵌入染料的存在,6,、 离子强度影响,琼脂糖凝胶电泳原理,实验材料,电泳指示剂,：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。,染料,：,Gelview,、,EB,电泳缓冲液,：,TBE,琼脂糖,DNA Marker 5000,含有分子量不同的,DNA,片段，主要用途就是,DNA,分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测目的基因片段大小。,应选择在目标片段大小附近,ladder,较密的,marker,，这样对目标片段大小的估计较准确。,DNA Marker,实验材料,凝胶准备,胶床准备,铺胶,静置,胶床置于电泳槽中,加电泳缓冲液,拔梳子,上样,电泳,取出凝胶,拍照,实验步骤,本实验所扩增的产物,DNA,片段长度,400bp,500bp,可取,5,l,PCR,产物以,1%,琼脂糖凝胶电泳进行检测。利用标准,DNA marker,评估扩增的特异性。,琼脂糖凝胶电泳,倒胶时把握好胶的温度,，不要高于,60,，否则温度太高会使制板变形,胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔,电泳前，确认样品孔位于电场负极；,点样时枪头下伸，,点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多,Gelview,有毒，,切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔,紫外线照射不要太久,注意事项,