HPLC方法的建立

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,浅谈,RP-HPLC,方法的建立,蒋 辉,防化研究院生物有机实验室,浅谈,RP-HPLC,方法的建立,1,总论,2,卓有成效的工作方法,3,样品的性质和预处理,4,分离的基础,5,系统方法的建立,6,保证柱寿命和性能的步骤,高效液相色谱法,总论,绝大多数实验室中，,HPLC,方法的建立仍在靠经验进行,首先进行反相色谱实验，调整流动相中有机相的比例，以求得足够的分离度、合理的操作时间以及易于检测的谱带。,改用不同的色谱柱，改变温度和流动相,pH,值，优化筛选溶剂的配比组成，以其它溶剂代替原来有机溶剂。或者试用别的,HPLC,方法,卓有成效的工作方法,1,首先估价样品与分离目的（切不可低估此步的重要性）,2,设计开始的分离条件，使之有可能在一两次实验中，便可能得到有希望的色谱图。,3,预测可能发生的问题，当问题出现时，能用已知的办法解决。,卓有成效的工作方法,4,有限考虑试用最有希望的、能控制的分离方法。,5,应对每次实验进行设计，能提供有用信息。,6 HPLC,的目的是分离，而不必使所需谱峰,“,过渡分离,”,。,样品的性质和预处理,可直接进样的样品溶液,需稀释缓冲,pH,或添加另一液体的溶液,能在流动相中溶解的固体,含有干扰物质或,“,损柱剂,”,而必须在进样前 将其去除的溶液,含有不容性赋性剂的混合物（动植物组织，高交联度聚合物、干性黏合剂）,绝大多数样品需经称重或稀释后进样，一般使最终样品液与流动相的成分尽量相近。,分离的基础：流动相的作用,要分离好的好，有两条途径：一是谱带窄，即柱效高；再就是谱带间距离大。,R,s,=(t,2,-t,1,)/(1/2(w,1,+w,2,),t,1,，,t,2,为二相邻谱带间的保留时间，,w,1,和,w,2,为它们基线处的峰宽。,R,s,为其分离度。,R,s,1.5,时 为完全分离。,当峰发生重叠时，难以准确测量到基线处的峰宽，更的办法好是用半高处的相应峰宽,1,和,2,：,R,s,= 1.18(t,2,-t,1,)/ (,1,+,2,),R,s,1.25,在一般情况下，能达到,99,的分离度。,新柱的起始色谱图的,R,s,值越大，意味着该柱用此法时间越长。,R,s,1.0,时 定量分析一般精密度较差。,分离度与溶剂强度的关系,R,s,=(1/4)(,-1)N,0.5,k,/(1+k,),k,代表了溶剂强度；,为分离因子；,N,为理论塔板数。,溶剂强度的增大，,R,s,增大，满意的范围,1 k,20,在反相,HPLC,中溶剂强度会随着水,/,有机流动相中的有机相增加而增加。,柱类型与温度选择性的关系,柱类型不同，选择性也不一样，这与键和相有关。,温度的选择性，温度的变化会影响分离度，因为理解的程度与温度有关。,色谱柱与塔板数的关系,一般塔板数越大，分离度越好,合格的,HPLC,的塔板数，一般不应低于标准值的,80,，否则为不合格。,色谱柱条件,流速适中，过高会降低塔板数。,当流动相粘度增加时，塔板数会降低，,对于反相体系，水的粘度较高意味着在高温时操作有利于最大限度的增大塔板数，在,50,度时较好。,其他因素,工作压力：低于,150bar,操作时间：应尽可能短,峰高：只要检测灵敏度有限，需要窄而高的峰,溶剂应用：对日常工作、大量实验，每次进样少消耗流动相为好,色谱柱问题与解决办法,保留值与分离度的重现性,1,选柱时，应考虑其化学性质,2,在流动相中用缓冲剂，以除去化学的或硅羟基效应，尽量减少谱峰拖尾。,3,保证温度、流速、和压力、溶剂成分恒定,4,脱气,5,保证上样不超载,1,10ug/mg,填料。,6,使用同一批生产批号的材料,谱峰拖尾,柱坏,污物在柱进口处堆积,样品超载,样品溶剂不合适,化学或次级保留效应,缓冲不足,重金属污染,柱外效应,进样阀体积过大,进样阀、色谱柱及检测器之间的管线过长或直径过粗,检测器流动池体积过大,系统方法的建立,1,检测条件的选择,2,梯度洗脱进行首次实验,3,优化流动相的选择性,提高分离度有三种方法：,1,提高塔板数,2,改变有机相比例，以改变谱峰间距,3,更换流动相溶剂，以改变谱峰间距,梯度洗脱优点,一次初始的梯度操作通常足以判断出大约正确的溶剂强度的流动相，使样品充分分离，通过分析谱峰，简化分确定离条件的步骤,建议用乙腈,/,水作流动相进行首次分离,乙腈操作压力低，溶剂强度高，检测波长宽：可在,185,205nm,检测,其他有机溶剂：甲醇，丙醇，异丙醇，四氢呋喃,反相,HPLC,中的溶剂优化,MeOH,ACN,THF,似乎可以满足反相,HPLC,要求：,容易样品：,ACN/,水,一般样品：,MeOH/,水,THF/,水,困难样品：多员梯度,优化反相,HPLC,步骤,1,选择标准梯度条件进行首次实验,乙腈,/,水,5,100,25min,2ml/min,或,乙腈,/,水,5,100,50min,1ml/min,2,调整梯度范围，尽可能减少色谱图开始和结束时的时间浪费,3,如果色谱峰复杂，分离较差：,延长梯度时间,加长柱长,使用细粒度的柱,降低流速以提高塔板数,4,一旦色谱图中能容纳所用峰，改变流 速以调整峰间距,5,需要进一步改变谱峰间距，改变有机溶剂,重现性好的分离,色谱平衡,通常情况下，柱子用,15,20,柱体积的起始流动相充分冲洗后方可达到柱平衡。柱再生所需时间通常约等于梯度时间。,基线问题,等梯度,HPLC,等梯度反相分离,保证柱寿命和性能的步骤,1,选择好填充柱,2,减小压力波动，避免冲撞击,3,用保护柱和在线过滤片,4,经常用强溶剂冲洗柱子：反相用,1:1,的异丙醇,/,氯仿，正相用甲醇,5,样品预处理，尽量减少无谓的强滞留成分和微粒,6,用较柔和的,pH,值,3,7,；防止键和相的流失,7,储存时冲洗掉盐缓冲液，以纯乙腈保存柱， 避免高浓度的水和醇类,