FISH实验

荧光原位杂交技术及其应用,一、荧光原位杂交技术简介二、FISH实验及图例展示,主要内容,一、荧光原位杂交技术简介,1、FISH的原理,2、FISH的发展,3、FISH的应用,1、FISH的原理,荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization)的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，在已有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性DNA分子原位杂交技术。它利用荧光标记的核酸片段为探针与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，通过荧光检测系统将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来,。,2、FISH的发展,1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的DNA探针检测细胞制片上非洲爪蟾细胞核内的rDNA获得成功。,1981年，Langer等建立了非放射性原位杂交技术。,20世纪90年代，FISH在方法上逐步形成了从单色向多色、从中期染色体FISH向粗线期染色体FISH再向fiber-FISH的发展趋势，灵敏度和分辨率也有了大幅度的提高。,M-FISH可将多次繁琐的FISH实验和多种不同基因的定位在一次FISH实验中完成。以下五种方法是在多彩色FISH基础上发展起来的新技术：染色体描绘、比较基因组杂交、光谱染色体自动核型分析、交叉核素色带分析、多彩色原位启动标记。,2.1 多色荧光原位杂交（M-FISH）,利用化学方法将染色体进行线性化，再以此线性化的染色体DNA 作为载体进行FISH，使FISH的分辨率显著提高。它在染色体图谱绘制，基因重组研究以及临床染色体基因序列检测工作中起着十分重要的作用。,2.2 DNA纤维荧光原位杂交技术（DNA fiber-FISH）,2.3 荧光免疫核型分析和间期细胞遗传学(FICTION),FICTION是一种将免疫核型分析和原位杂交相结合的方法，这种方法可以同时显示异种细胞群中单个肿瘤细胞的免疫表型和一定的基因改变。,FICTION可用于分析血液肿瘤的系谱以获得对肿瘤病理组织更好的了解。,3、FISH的应用,FISH技术已经在细胞遗传学、基因图谱等科研领域；肿瘤生物学、基因定位、基因扩增、产前诊断及哺乳动物染色体进化等医学领域；微生物检测等环境和食品领域,得,到了广泛应用。,环境监测领域：近几年, 由于FISH 技术的灵敏性和快捷性使其成为微生物系统发育学、微生物生态学、微生物诊断学和环境微生物学研究的有力工具。FISH 技术可以再现微环境中完整细胞的景象信息, 具有更好的精确性,因此在环境微生物多样性等研究领域被广泛采用。近几年, 应用FISH 技术研究自然环境微生物群落的报道较多, 如海水沉积物的群落, 海水、河水和高山湖雪水的浮游菌体、土壤和根系表面的寄居群落,等,。,食品检测方面：传统的食品微生物检测大多采用培养分离的方法，食品中菌落总数测定采用平板计数法获得结果需要1-2 d，致病菌的检测包括前增菌、选择性增菌、镜检以及血清学验证等一系列的检测程序大概需要57d。FISH 技术与传统方法相比，具有快速、简便的优点。,医学的产前诊断：染色体异常是引起新生儿先天性遗传病的主要因素之一。胎儿染色体数目异常可导致胎儿流产，死胎，存活患儿常表现为各种综合征，涉及多发畸形，生长发育迟缓，智力低下等，FISH方法能快速诊断胎儿常见的-三体型及性染色体数目异常，且可靠性达99% 以上，为产前诊断的快速检测提供了新的有效手段。,荧光原位杂交应用最成功的是基因定位。基因定位研究是构建基因图谱的基本要素, 基因位置的确定有助于了解基因的功能, 利用FISH 技术, 可以直接确定某一DNA 序列在染色体上的位置。,二、,FISH,实验及图例展示,1、样本的准备与处理,2、,实验操作及注意事项,3、实验结果的检测,4、实验图例的展示,1、样本的准备与处理,FISH实验在样本准备方面，组织取材应尽可能新鲜，由于组织核酸降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30min内固定。虽冷冻组织样本、细胞涂片、培养细胞爬片及中期染色体等材料进行FISH的结果优于石蜡包埋组织样本的杂交效果，但是石蜡切片易制作，易保存，且操作过程中不易掉片，所以石蜡切片的样本较常用。石蜡切片在实验时首先要用二甲苯脱蜡。,2、实验操作及注意事项,实验操作过程中的注意事项,a、石蜡切片脱蜡过程要脱蜡完全。,b、需预热的洗液和变性液应该提前放于达到预热温度的水浴锅内，预热至少30min。,c、操作过程中应该尽量减少探针接触白光时间，减少荧光的损耗。,d、实验过程中最好设立一个阴性对照组，不加探针，直接用洗液代替探针进行孵育，排除组织本身的非特异性表达。,e、根据切割组织样本的厚度不同，以及样本组织的不同，消化时间适当增减。,f、链DNA探针和靶DNA的变性。,3、实验结果的检测,实验完成后，用抗荧光衰减封片剂封片后，通过荧光显微镜采用相应的波长进行检测；如果不能立即检测，做好的样本要避光保存在-20。,所用不同荧光材料的激发光和发射光波长及滤光镜选择,4、,实验图例的展示,人齿禹牙髓组织POU5F1基因检测,中红侧沟茧蜂触角 MmedOR1、MmedOBP3、MmedOR5基因检测,鸡子宫SLCO1B3基因检测,猪耳蜗Phytase基因检测,乳腺癌组织ETV1基因的检测,人乳腺癌组织COP1基因检测,微生物菌群检测,白纹伊蚊卵巢组织 Phage WO 基因检测,现今越来越多的学者趋向于FISH与IF的结合实验，通俗一点讲，就是在同一个样本上既进行FISH实验，又同时进行IF实验检测。这方面实验一般适用于检测一个目的基因以及该目的基因所相对应的蛋白，我们公司在这方面实验上条件已非常成熟。另外公司也提供其他方面的实验服务，有Southern blot 、Northern blot、CHIP、COIP，QPCR等等；蛋白类实验有IHC、IF、WB等。,FISH与IF的结合实验实例,小鼠血管,人病变血管,常见问题解答,石蜡组织切片FISH检测结果受其他诸多因素的影响，如组织标本的解剖位置、标本厚度、固定条件、实验室环境、操作人员的差异、蛋白酶效价的差异、探针的质量等，都可能影响实验结果。我们实验室已进行过多种标本的FISH检测，会根据不同的样本在一定范围内对实验条件进行适当调整优化，从而获得理想的实验结果。,石蜡常见样本图释,