第一节免疫标记技术的基本概念课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2019-7-16,谢谢欣赏,*,免疫标记技术,1,谢谢欣赏,2019-7-16,第一节 免疫标记技术的基本概念,一、免疫标记与标记免疫的概念,二、常用的免疫标记物质,2,谢谢欣赏,2019-7-16,免疫标记与,标记免疫,免疫标记技术,：,标记物与免疫活性物质的联接技术,标记免疫技术,：,以标记免疫物质检测相应靶物质的技术,3,谢谢欣赏,2019-7-16,常用的免疫标记物质,类别 标记物 用途,荧光素,FITC,、,RB200,、,TRITC,免疫组化,镧系元素螯合物 免疫分析测定,放射性核素,3,H,、,14,C,、,32,P,、,57,Gr,免疫分析测定,125,I,、,131,I,酶,HRP,、,AP,免疫组化,免疫分析测定,化学发光物,Luminol,、,lucigenin,免疫分析测定,金属颗粒 胶体金、铁蛋白 免疫组化,免疫分析测定,4,谢谢欣赏,2019-7-16,第二节 酶标记技术,一、常用标记方法,二、标记免疫物的分离与鉴定,5,谢谢欣赏,2019-7-16,常用标记方法,1,、常用酶,辣根过氧化物酶（,HRP,）,碱性磷酸酶（,AP,）,2,、标记方法,戊二醛交联法,过碘酸盐氧化法,6,谢谢欣赏,2019-7-16,戊二醛交联法,(,一步法）,抗体,-NH,2,+ COH-,（,CH,2,）,3,-COH + NH,2,-,酶,抗体,-NH,2,=CH-,（,CH,2,）,3,-CH = NH,2,-,酶,抗体,-NH,2,=CH-,（,CH,2,）,3,-CH = NH,2,-,抗体,酶,-NH,2,=CH-,（,CH,2,）,3,-CH = NH,2,-,酶,7,谢谢欣赏,2019-7-16,戊二醛交联法（二步法）,COH-,（,CH,2,）,3,-COH + NH,2,-,酶,抗体,-NH,2,+ CHO-,（,CH,2,）,3,-CH = NH,2,-,酶,抗体,-NH,2,=CH-,（,CH,2,）,3,-CH = NH,2,-,酶,8,谢谢欣赏,2019-7-16,过碘酸盐氧化法,O,O,O,O,O,O,NaIO,4,O,O,OH,O,O,OH,OH,+ NH,2,抗体,O,O,O,N,N,抗体,抗体,H,2,O,N,抗体,NaBH,4,Schiff,碱,酶,-,五炭糖环,9,谢谢欣赏,2019-7-16,标记免疫物的分离与鉴定,1,、分离,目的：去除游离酶,方法：盐析、柱层析,2,、鉴定,抗体活性,酶活性,标记物纯度,10,谢谢欣赏,2019-7-16,第三节 荧光标记技术,一、常用标记方法,二、标记免疫物的分离与纯化,11,谢谢欣赏,2019-7-16,常用标记方法,1,、荧光素的概念,2,、生物标记荧光素的要求,3,、常用荧光素标记原理与方法,12,谢谢欣赏,2019-7-16,生物标记荧光素的要求,1,、具有与蛋白质共价结合的能力,2,、荧光效率高,3,、能与背景物质形成鲜明对比,4,、不影响蛋白质的生物、免疫活性,5,、标记方法安全、简便,6,、标记物稳定，易保存,13,谢谢欣赏,2019-7-16,FITC,的标记原理与方法,荧光素,-N=C=S + NH,2,-,抗体,荧光素,-N-C-N-,抗体,H S H,14,谢谢欣赏,2019-7-16,RB200,的标记原理与方法,荧光素,-SO,3,Na + PCl,5,荧光素,-SO,2,Cl,+,PCl,3,+ NaCl,荧光素,-SO,2,Cl,+ NH,2,-,抗体,荧光素,-SO,2,-NH-,抗体,+ HCl,15,谢谢欣赏,2019-7-16,标记免疫物的分离与鉴定,1,、分离,目的：去除游离荧光素,方法：柱层析,2,、鉴定,抗体活性,标记物结合度,F/P,比值的应用意义,16,谢谢欣赏,2019-7-16,第四节 放射性核素标记技术,一、常用标记方法,二、标记免疫物的分离与纯化,17,谢谢欣赏,2019-7-16,常用标记方法,1,、常用放射性核素,2,、,125,I,的标记方法,直接法（氯胺,T,法）,间接法（连接法）,18,谢谢欣赏,2019-7-16,直接法（氯胺,T,法）,OH,-NHCHONH-,CH,2,OH,-NHCHONH-,CH,2,Na,125,I 4,。,C,125,I,氯胺,T,19,谢谢欣赏,2019-7-16,间接法（连接法）,CH,2,OH,O,H-C-C-O-N-C-CH,2,H O O=C-C-CH,2,CH,2,OH,O,H-C-C-O-N-C-CH,2,H O O=C-C-CH,2,+ Na,125,I,氯胺,T,125,I,NSHPP,20,谢谢欣赏,2019-7-16,间接法（连接法）,CH,2,OH,O,H-C-C-O-N-C-CH,2,H O O=C-C-CH,2,CH,2,OH,H-C-C-N-,蛋白质,H O H,+ NH,2,-,蛋白质,125,I,125,I,21,谢谢欣赏,2019-7-16,标记免疫物的分离与鉴定,1,、分离,目的：去除游离放射性核素,方法：柱层析,2,、鉴定,游离放射性核素含量,免疫活性,比放射性（,mCi,/mg,）应用意义,22,谢谢欣赏,2019-7-16,本章小结,1,、免疫标记技术的概念,2,、常用免疫标记物质及其标记方法,3,、标记免疫物质的分离与鉴定,23,谢谢欣赏,2019-7-16,思考题,1,、何谓免疫标记技术？,2,、常用的免疫标记物质有哪些？,3,、酶标记的主要方法有哪些？,4,、,F/P,比值的实用意义如何？,5,、何谓比放射性？有何意义？,24,谢谢欣赏,2019-7-16,标记免疫技术的应用,25,谢谢欣赏,2019-7-16,第一节 标记免疫技术的分类,一、按指示标记物质划分的类型,二、按测定方式划分的类型,三、,按测定用途,划分的类型,26,谢谢欣赏,2019-7-16,1,、酶免疫技术,2,、荧光免疫技术,3,、放射免疫技术,4,、发光免疫技术,5,、金免疫技术,按指示标记物质划分的类型,27,谢谢欣赏,2019-7-16,1,、均相型（,homogenous,）,2,、非均相型（,heterogeneous,）,按测定方式划分的类型,28,谢谢欣赏,2019-7-16,均相型（,homogenous,）,非均相型（,heterogeneous,）,29,谢谢欣赏,2019-7-16,双标记均相荧光免疫测定,30,谢谢欣赏,2019-7-16,酶扩大免疫测定技术,31,谢谢欣赏,2019-7-16,1,、免疫测定技术,2,、免疫组化技术,按测定用途划分的类型,32,谢谢欣赏,2019-7-16,第二节 酶联免疫吸附试验,一、,ELISA,技术的原理与方法,二、,ELISA,技术的操作注意要点,33,谢谢欣赏,2019-7-16,ELISA,技术的原理与方法,间接法,夹心法,竞争法,34,谢谢欣赏,2019-7-16,间接法,35,谢谢欣赏,2019-7-16,夹心法,36,谢谢欣赏,2019-7-16,竞争法,37,谢谢欣赏,2019-7-16,酶标仪,38,谢谢欣赏,2019-7-16,酶标仪,39,谢谢欣赏,2019-7-16,ELISA,技术的操作注意要点,试剂器材,操作环节,合适工作浓度,40,谢谢欣赏,2019-7-16,第三节 荧光抗体技术,一、荧光抗体技术的原理与方法,二、荧光抗体技术的操作注意要点,41,谢谢欣赏,2019-7-16,荧光抗体技术的原理与方法,直接法,间接法,补体法,双标记法,42,谢谢欣赏,2019-7-16,直接法,间接法,补体法,双标记法,43,谢谢欣赏,2019-7-16,荧光抗体技术的操作注意要点,标本处理,染色操作,结果观测,44,谢谢欣赏,2019-7-16,荧光显微镜,45,谢谢欣赏,2019-7-16,荧光显微镜使用原理,激发滤片（,BG,）,吸收滤片（,OG,）,标本,FITC,吸收光峰值：,490-495nm FITC,发射光峰值：,520-530nm,BG,：,325-500 OG,：,410-650,46,谢谢欣赏,2019-7-16,激发滤片,吸收滤片,荧光滤镜使用原理,47,谢谢欣赏,2019-7-16,第四节 放射免疫测定技术,一、放射免疫测定技术的原理与方法,二、放射免疫测定技术的操作注意要点,48,谢谢欣赏,2019-7-16,结合相,游离相,放射免疫分析法的原理与方法,49,谢谢欣赏,2019-7-16,1 2 5 10 20 50 100,40,30,20,10,未标记抗原含量,结合、游离相放射性含量比值,50,谢谢欣赏,2019-7-16,液闪仪,51,谢谢欣赏,2019-7-16,计数器,52,谢谢欣赏,2019-7-16,放射免疫测定技术的操作注意要点,反应的温度与时间,结合相与游离相的分离,53,谢谢欣赏,2019-7-16,免疫标记技术的比较,FIA ELISA RIA,敏感性 较低 高 高,特异性 高 高 高,重复性 差 好 好,检测对象,Ag/Ab Ag/Ab,Ag,54,谢谢欣赏,2019-7-16,本章小结,1,、标记免疫技术的类型,2,、,ELISA,技术的原理与方法,3,、荧光抗体技术的原理与方法,4,、,RIA,技术的原理与方法,55,谢谢欣赏,2019-7-16,思考题,1,、如何区别均相型与非均相型的测定方式？,2,、,ELISA,分几种类型，各有哪些特点？,3,、适于标记的荧光素应符合哪些要求？,56,谢谢欣赏,2019-7-16,