琼脂糖凝胶电泳检测dna

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,琼脂糖凝胶电泳检测,DNA,丁新伦,dingxinlun,13067206406,【,一,】,背景知识,凝胶电泳是分离和纯化,DNA,片段最常用的,技术；,分离、鉴定和提纯核酸首选的标准方法。,根据,制备凝胶的材料,:,琼脂糖,电泳,凝胶,电泳 聚丙烯酰胺,电泳,【,二,】,实验目的,学习琼脂糖凝胶电泳分离,DNA,的原理和方法,检测碱裂解法提取质粒的结果,检测双酶切法鉴定重组质粒的结果,检测,PCR,法鉴定重组质粒的结果,【,三,】,实验原理,（,1,）某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳的速率，电泳的速率与核酸分子大小和构型有关。,DNA,分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。,分子质量越小跑得越快，紧密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可以分离大小不同的,DNA,或,RNA,分子。,（,2,）琼脂糖,是一,种,线性多糖聚合物,，,可以形成具有刚性的滤孔,，凝胶孔径的大小决定于,琼脂糖的浓度,。,浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,琼脂糖浓度,(%),线型,DNA,分子的分离范围,(Kb),0.3,5,60,0.6,1,20,0.7,0.8,10,0.9,0.5,7,1.2,0.9,6,1.5,0.2,3,12.0,0.1,2,配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的,DNA,分子大小来确定。,（,3,）溴化,乙锭为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。,EB,可与,DNA,分子,形成,EB-DNA,复合物，,其荧光强度与,DNA,的含量,成正比,。据此,可判断,DNA,分子量大小和粗略,估计样品,DNA,浓度。,琼脂糖是一种线性多糖聚合物。,浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,琼脂糖浓度,(%),线型,DNA,分子的分离范围,(Kb),0.3,5,60,0.6,1,20,0.7,0.8,10,0.9,0.5,7,1.2,0.9,6,1.5,0.2,3,12.0,0.1,2,【,四,】,仪器、材料与试剂,质粒样品、酶切样品和,PCR,样品。,凝胶电泳系统和电泳图像分析系统,(,凝胶成像系统,),等。,琼脂糖、,1X,TBE,电泳缓冲液,、,溴化乙锭,、,6X,载样缓冲液,（,6X loading buffer,）和,DNA,分子量标准（,Lambda DNA /,Eco,RI +,Hin,dIII Marker,）等。,凝胶电泳系统,DYY-6C,型 双稳定时电泳仪电源（北京六一）,输出范围（显示分辨率）：,6-600V(1V) 4-400mA(1mA) 240W,美国,Bio-rad,伯乐 小型水平电泳槽,Mini-Sub Cell GT Cell,凝胶成像分析系统,Lambda DNA /,Eco,RI +,Hin,dIII Marker,（,Ferments,）,一个已知分子质量的,DNA,样品做最对照，用来确定待测样品的相对分子质量。,常用电泳缓冲液,缓冲液,缓冲容量,迁移速度,分辨率,用途,TAE,最低,最快,(,高,10,),高分子量高,高度复杂,DNA,混合物；超螺旋,DNA,TBE,很高,较慢,低分子量高,价格昂贵，不常用,TPE,电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖,400,组成上样缓冲液。,作用：,增加样品比重，以确保,DNA,均匀沉入加样孔内。,形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。,使样品呈色，使加样操作更方便。,上样缓冲液,溴化乙锭,溴化,乙锭,（ 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐,EthidiumBromide，EB）,，,EB,染色（,EB,可很好地掺入到双链,DNA,中），在紫外光下会发出橙红色的荧光，用于对,DNA,进行染色和观察。,用于观察的紫外光有种波长，一般使用中波紫外光（）。,短波紫外光（）观察效果较好，但对,DNA,的破环很大。,长波紫外光（）：回收。,EB,染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20,min；,不会使核酸断裂；灵敏度高，10,ng,或更少的,DNA,即可检出；可以加到样品中或胶中。,EB,是诱变剂，使用时一定要戴手套。,EB,废液要经过处理才能丢弃。,SYBR:,新型低毒，高灵敏度染料，加入样品中，价格较昂贵。,【,五,】,实验步骤,制备琼脂糖凝胶（,1%,）,制备凝胶板,加样,电泳,染色,结果观察,（,1,）制备凝胶和胶板,：,45,ml(1TBE)+0.4g,琼脂糖（ 三角瓶,），,煮胶，溶解，冷却至,60(,不烫手,),，倒板,(4-6mm),，室温下充分凝固，竖直拔下梳子 。,胶板设计（,44,人）：,每,18,孔胶板（,5,人,X3,样品,+1marker,），,8,胶板,每,8,孔胶板（,2,人,X3,样品,+ 1marker,），,2,胶板,（,2,）,加样,：,5l,质粒,DNA+1l loading buffer,，,混匀,15lPCR,产物,+3l loading buffer,，混匀,10l,酶切产物,+2l loading buffer,，混匀,6lDNAMark,（每板胶加一孔）,（,3,）电泳,：,电压,3-5V/cm,，约,80-90V,，注意电极方向,（,4,）染色,：,EB,染色约,15min,（,5,）观察：紫外透射分析仪下观察。,【,六,】,实验结果,