5.常用生物化学检验技术

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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,常用生物化学检验技术,第五章,1,第一节 光谱分析技术,第二节 电化学分析,第三节 电泳技术,第四节 层析技术,第五节 离心技术,第六节 自动生化分析技术,只讲第一节,其它内容在临床检验仪器学中讲授。,本章内容概要,2,教学目标和要求,1、,掌握,分光光度技术的基本原理及定性和定量方法。,2、,熟悉,分光光度计的的基本结构和操作方法光源检查,和波长校正、原子分光光度计的类型和影响荧光分析的,因素,3、,了解,其他光谱分析技术的基本原理及在生化检验中,的应用。,3,第一节 光谱分析技术,分光光度技术的基本原理,分光光度计的基本结构,分光光度计的操作方法,分光光度技术的定性和定量方法,4,光谱分析技术原理:,利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征,以此来确定物质性质、结构或含量。,光谱分析技术分类:,发射光谱分析技术:,火焰光度法、原子发射光谱法和荧光光谱法,吸收光谱分析技术:,紫外、可见光分光光度法,原子吸收分光光,度法和红外光谱法,散射光谱分析技术:,比浊法,5,一、分光光度技术的基本原理,(一)吸光度与透光度,A = -lgT = -lgI/I,0,= lgI,0,/I,当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况:一部分光被散射,一部份光被吸收,另有一部分光透过溶液。设入射光强度为I0,透射光强度为I,I和I,0,之比称为透光度,,,即:,T = I/I,0,T100为T%称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光度即:,6,(二)Lambert-Beer定律,Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层,厚度之间关系的基本定律,该定律是分光分析的理论基础。其,表达式为:,A = KLC,式中A为吸光度;K为比例常数,称为吸光系数;L为溶液,层厚度,称为光径;C为溶液浓度,(Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。),7,据Lambert-Beer定律,当液层厚度为cm,浓度单位为mol/L时,吸光系数K称为摩尔吸光系数()。的意义是:当液层厚度为1cm,物质浓度为1mol/L时在特定波长下的吸光度值。是物质的特征性常数。,8,(三)偏离Lambert-Beer定律的因素,应用Lambert-Beer定律产生误差主要来源于光学,和化学两方面的因素。,1,光学因素:,要求入射光是单色光。入射光的谱带越宽,其误差越大。,2,化学因素:,浓度、pH、溶剂和温度等因素可影响化学平衡。,9,二、分光光度计的基本结构,最常用的是,可见分光光度计,和,紫外-可见光分光光度计,光源,单色器,比色杯,检测器,显示器,五大部份,结构:,10,(一)光源,光源定义:,指一种可以发射出供溶液或吸收物质选择性吸收的光。光源应在一定光谱区域内发射出连续光谱,并有足够的强度和良好的稳定性,在整个光谱区域内光的强度不应随波长有明显的变化。,光源种类:,可见光分光光度计常用光源是,钨灯或卤钨灯。,紫外光光度计常用,氢灯,作为光源。,11,(二)单色器,定义:,将来自光源的复合光分散为单色光的装置称为分,光系统或单色器。,种类:,滤光片,棱镜,光栅,12,(三)比色杯,又称为吸收池或比色皿,材料:,常用无色透明、耐腐蚀和耐酸碱的玻璃或石英材料做成,(五)显示器,(四)检测器,检测器是将透过溶液的光信号转换为电信号,并将电信号,放大的装置。常用的检测器为光电管和光电倍增管。,是将光电管或光电倍增管放大的电流通过仪表显示出来的,装置。,13,三、分光光度计的操作方法,(一)分光光度计的基本操作,以721-A型分光光度计为例,其基本的操作步骤为:,1.开721-A分光光度计的开关,将比色池的盖子打开,通电20分钟使仪器预热。,2.将波长旋至测定的波长。,3.将空白液、校准液或待测液放入比色池,将空白液置于光路中。,4.将开关置于T位,打开比色池盖子,用光量粗调和光量细调调节T为0.0,关上,比色池盖子,调节T为100.0。,5.将开关置于A,用消光调零调节A为0.0,6.重复步骤4和5,7.将校准液或待测液推入光路,测量溶液的吸光度(A),14,(二)吸光度的校正,铬酸钾的标准液可用于校正分光光度计的吸光度。在25,将4mg铬酸钾溶于100ml的0.05mol/L KOH中,放入比色池中,在不同波长下测定吸光度值,与己知的标准吸光度校正表进行比较,可检测仪器吸光度的准确度,。,15,四、分光光度技术的定性和定量方法,(一)分光光度技术的定性方法,定性依据:,最大吸收波长max和摩尔吸光系数,2.摩尔消光系数方法,1.最大吸收波长max方法,16,(二)分光光度技术的定量方法,1.标准曲线法,根据Lambert-Beer定律,液体的浓度在一定范围内与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准品溶液(浓度应包含高、中、低浓度范围),按标本处理方法作相同处理,在特定波长下测定吸光度,,以标准液浓度为横座标,以吸光度为纵座标,,按最小二乘法的原理,将对应各点连成一条通过原点的直线,这条直线称为标准曲线。待测溶液测定吸光度后,从标准曲线上可查出其相应的浓度。,方法:,17,制作和应用标准曲线时应注意下面几点:,(1)测定条件发生变化时(如更换标准品和试剂等),应重新,绘制。,(2)标准品应有高的纯度,标准液的配制应准确。,(3)当待测液吸光度超过线性范围时,应将标本稀释后再测定。,(4)标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。,18,2比较法,C,u,=(A,u,C,s,)/A,s,己知浓度的标准品和标本作同样处理,使用相同的空白,,同时测定标准管和标本的吸光度,根据测定的吸光度及标准,品浓度,可直接计算出标本的浓度,计算公式为:,其中Cu和Au为标本管浓度和吸光度,Cs和As分别为标准,管浓度和吸光度。用标准品法定量时,标准品的浓度应尽量,和标本管浓度相近。,19,3其它分析方法,包括差示法、多组份混合物分析和利用摩尔吸光系数分析等方法。,20,五、其它光谱分析技术,(一)火焰光度法,(二)原子吸收分光光度法,(三)荧光光度分析法,1基本原理 2组成,1基本原理 2组成 3原子吸收分光光度法的特点,3荧光光度定量分析法 4 荧光光度分析技术的应用,1基本原理 2影响荧光强度的因素,21,
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